Abstract Background and purpose Brain ischemia is one of the most important pathologies of the central nervous system. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide critical insights into the temporal dynamics and follow alterations of receptor expression and metabolism in ischemic stroke. The aim of this study was to assess the cannabinoid type 2 receptors (CB 2 R) levels in transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) mouse models at subacute stage using positron emission tomography (PET) with our novel tracer [ 18 F]RoSMA-18-d6, and structural imaging by magnetic resonance imaging (MRI). Methods Our recently developed CB 2 R PET tracer [ 18 F]RoSMA-18-d6 was used for imaging the neuroinflammation at 24 h after reperfusion in tMCAO mice. The RNA expression levels of CB 2 R and other inflammatory markers were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction using brain tissues from tMCAO (1 h occlusion) and sham-operated mice. [ 18 F]fluorodeoxyglucose (FDG) was included for evaluation of the cerebral metabolic rate of glucose (CMRglc). In addition, diffusion-weighted imaging and T 2 -weighted imaging were performed for anatomical reference and delineating the lesion in tMCAO mice. Results mRNA expressions of inflammatory markers TNF-α , Iba1, MMP9 and GFAP, CNR2 were increased at 24 h after reperfusion in the ipsilateral compared to contralateral hemisphere of tMCAO mice, while mRNA expression of the neuronal marker MAP-2 was markedly reduced. Reduced [ 18 F]FDG uptake was observed in the ischemic striatum of tMCAO mouse brain at 24 h after reperfusion. Although higher activity of [ 18 F]RoSMA-18-d6 in ex-vivo biodistribution studies and higher standard uptake value ratio (SUVR) were detected in the ischemic ipsilateral compared to contralateral striatum in tMCAO mice, the in-vivo specificity of [ 18 F]RoSMA-18-d6 was confirmed only in the CB 2 R-rich spleen. Conclusions This study revealed an increased [ 18 F]RoSMA-18-d6 measure of CB 2 R and a reduced [ 18 F]FDG measure of CMRglc in ischemic striatum of tMCAO mice at subacute stage. [ 18 F]RoSMA-18-d6 might be a promising PET tracer for detecting CB 2 R alterations in animal models of neuroinflammation without neuronal loss.

Abstract Purpose The angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) plays a regulatory role in the cardiovascular system and serves SARS-CoV-2 as an entry receptor. The aim of this study was to synthesize and evaluate radiofluorinated derivatives of the ACE2 inhibitor MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were demonstrated to be suitable for non-invasive imaging of ACE2, potentially enabling a better understanding of its expression dynamics. Methods Based on computational molecular modeling, the ACE2-binding modes of F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 were similar to that of MLN-4760. Co-crystallization of the hACE2/F-MLN-4760 protein complex was performed for confirmation. Displacement experiments using [ 3 H]MLN-4760 enabled the determination of the binding affinities of the synthesized F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 to ACE2 expressed in HEK-ACE2 cells. Aryl trimethylstannane-based and pyridine-based radiofluorination precursors were synthesized and used for the preparation of the respective radiotracers. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were evaluated with regard to the uptake in HEK-ACE2 and HEK-ACE cells and in vitro binding to tissue sections of HEK-ACE2 xenografts and normal organs of mice. Biodistribution and PET/CT imaging studies of [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were performed using HEK-ACE2 and HEK-ACE xenografted nude mice. Results Crystallography data revealed an equal ACE2-binding mode for F-MLN-4760 as previously found for MLN-4760 and indicated that the same would hold true for F-Aza-MLN-4760. The IC 50 values were all in the high nM range, but three-fold lower for F-MLN-4760 and seven-fold lower for F-Aza-MLN-4760 than for MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were obtained in 1.4 ± 0.3 GBq and 0.5 ± 0.1 GBq activity with >99% radiochemical purity in a 5.3% and 1.2% radiochemical yield, respectively. Uptake in HEK-ACE2 cells was higher for [ 18 F]F-MLN-4760 (67 ± 9%) than for [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 (37 ± 8%) after 3 h incubation while negligible uptake was seen in HEK-ACE cells (<0.3%). [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 accumulated specifically in HEK-ACE2 xenografts of mice (13 ± 2% IA/g and 15 ± 2% IA/g at 1 h p.i.) with almost no uptake observed in HEK-ACE xenografts (<0.3% IA/g). This was confirmed by PET/CT imaging, which also visualized unspecific accumulation in the gall bladder and intestinal tract. Conclusion Both radiotracers showed specific and selective binding to ACE2 in vitro and in vivo. [ 18 F]F-MLN-4760 was, however, obtained in higher yields and the ACE2-binding affinity was superior over that of [ 18 F]F-Aza-MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 would, thus, be the candidate of choice for further developlment to enable PET imaging of ACE2 in patients.

Abstract Background Myocardial perfusion imaging by positron emission tomography (PET-MPI) is the current gold standard for quantification of myocardial blood flow. 18 F-flurpiridaz was recently introduced as a valid alternative to currently used PET-MPI probes. Nonetheless, optimum scan duration and time interval for image analysis are currently unknown. Further, it is unclear whether rest/stress PET-MPI with 18 F-flurpiridaz is feasible in mice. Methods Rest/stress PET-MPI was performed with 18 F-flurpiridaz (0.6-3.0 MBq) in 29 mice aged 7-8 months. Regadenoson (0.1 μg/g) was used for induction of vasodilator stress. Kinetic modeling was performed using a metabolite-corrected arterial input function. Image-derived myocardial 18 F-flurpiridaz uptake was assessed for different time intervals by placing a volume of interest in the left ventricular myocardium. Results Tracer kinetics were best described by a two-tissue compartment model. K 1 ranged from 6.7-20.0 mL/cm 3 /min, while myocardial volumes of distribution ( V T ) were between 34.6 and 83.6 mL/cm 3 . Of note, myocardial 18 F-flurpiridaz uptake (%ID/g) was significantly correlated with K 1 at rest and following pharmacological stress testing for all time intervals assessed. However, while Spearman’s coefficients (r s ) ranged between 0.478 and 0.672, R 2 values were generally low. In contrast, an excellent correlation of myocardial 18 F-flurpiridaz uptake with V T was obtained, particularly when employing the averaged myocardial uptake from 20-40 min post tracer injection (R 2 ≥0.98). Notably, K 1 and V T were similarly sensitive to pharmacological stress induction. Further, mean stress-to-rest ratios of K 1 , V T , and %ID/g 18 F-flurpiridaz were virtually identical, suggesting that %ID/g 18 F-flurpiridaz can be used to estimate CFR in mice. Conclusion Our findings suggest that a simplified assessment of relative myocardial perfusion and coronary flow reserve (CFR), based on image-derived tracer uptake, is feasible with 18 F-flurpiridaz in mice, enabling high-throughput mechanistic CFR studies in rodents.

Abstract Purpose The angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) plays a regulatory role in the cardiovascular system and serves SARS-CoV-2 as an entry receptor. The aim of this study was to synthesize and evaluate radiofluorinated derivatives of the ACE2 inhibitor MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were demonstrated to be suitable for non-invasive imaging of ACE2, potentially enabling a better understanding of its expression dynamics. Methods Computational molecular modeling, based on the structures of human ACE2 (hACE2) and mouse ACE2 (mACE2), revealed that the ACE2-binding modes of F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 were similar to that of MLN-4760. Co-crystallization of the hACE2/F-MLN-4760 protein complex was performed for confirmation. Displacement experiments using [ 3 H]MLN-4760 enabled the determination of the binding affinities of the synthesized F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 to hACE2 expressed in HEK-ACE2 cells. Aryl trimethylstannane-based and pyridine-based radiofluorination precursors were synthesized and used for the preparation of the respective radiotracers. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were evaluated with regard to the uptake in HEK-ACE2 and HEK-ACE cells and in vitro binding to tissue sections of HEK-ACE2 xenografts and normal organs of mice. Biodistribution and PET/CT imaging studies of [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were performed using HEK-ACE2 and HEK-ACE xenografted nude mice. Results Crystallography data revealed an equal hACE2-binding mode for F-MLN-4760 as previously found for MLN-4760. Moreover, computer-based modeling indicated that similar binding to hACE2 and mACE2 holds true for both, F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760, as is the case for MLN-4760. The IC 50 values were three-fold and seven-fold higher for F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760, respectively, than for MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were obtained in 1.4 ± 0.3 GBq and 0.5 ± 0.1 GBq activity with > 99% radiochemical purity in a 5.3% and 1.2% radiochemical yield, respectively. Uptake in HEK-ACE2 cells was higher for [ 18 F]F-MLN-4760 (67 ± 9%) than for [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 (37 ± 8%) after 3-h incubation while negligible uptake was seen in HEK-ACE cells (< 0.3%). [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 accumulated specifically in HEK-ACE2 xenografts of mice (13 ± 2% IA/g and 15 ± 2% IA/g at 1 h p.i.) with almost no uptake observed in HEK-ACE xenografts (< 0.3% IA/g). This was confirmed by PET/CT imaging, which also visualized unspecific accumulation in the gall bladder and intestinal tract. Conclusion Both radiotracers showed specific and selective binding to ACE2 in vitro and in vivo. [ 18 F]F-MLN-4760 was, however, obtained in higher yields and the ACE2-binding affinity was superior over that of [ 18 F]F-Aza-MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 would, thus, be the candidate of choice for further development in view of its use for PET imaging of ACE2. Graphical abstract

Abstract Background Metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) modulates excitatory glutamatergic synaptic transmission and plays an important role in learning and memory formation and in neurodegeneration and amyloid deposition in Alzheimer’s disease (AD). Conflicting results on the cerebral mGluR5 levels in AD have been reported based on in vivo and postmortem studies. Here, we aimed to assess alterations in hippocampal mGluR5 expression in AD, and the associations between mGluR5 expression and pathologies. Methods Immunofluorescence staining for mGluR5 was performed on postmortem brain tissue from 34 AD patients and 31 nondemented controls (NCs) and from aged 3×Tg and arcAβ model mice of AD. Autoradiography was performed on brain tissue slices from arcAβ mice using mGluR5 tracer [ 18 F]PSS232. Analysis of different cellular source of GRM5 RNA in human and mouse brains was performed. Proteomic profiling and pathway analysis were performed on hippocampal tissue from aged 3×Tg mice and wild-type mice. Results No differences in hippocampal mGluR5 expression or entorhinal cortical GRM5 RNA levels were detected between the AD and NC groups. Hippocampal mGluR5 levels increased with Braak stage and decreased with amyloid level in the NC group. No correlations were detected between the levels of mGluR5 and amyloid, tau, or Iba1/P2X7R in the hippocampus of AD patients and NC cases. Ex vivo autoradiography revealed comparable cerebral levels of [ 18 F]PSS232 in arcAβ mice compared to nontransgenic mice. GO and KEGG pathway enrichment analyses revealed that the Shank3, Grm5 and glutamatergic pathways were upregulated in hippocampal tissue from aged 3×Tg mice compared to wild-type mice. Conclusion This study revealed no difference in hippocampal mGluR5 levels between AD patients and NCs and revealed the divergent influence of amyloid and tau pathologies on hippocampal mGluR5 levels in NCs. Species differences were observed in the GRM5 RNA level as well as at the cellular location. Graphical abstract

Abstract Neuroinflammation plays an important role in the pathophysiology of Alzheimer’s disease. The cannabinoid type 2 receptor (CB 2 R) is an emerging target for neuroinflammation and therapeutics of Alzheimer’s disease. Here, we aimed to assess the alterations in brain CB 2 R levels and evaluate novel CB 2 R imaging tracers in the arcAβ mouse model of Alzheimer’s disease amyloidosis. Immunohistochemical staining for Aβ deposits (6E10), microgliosis (anti-Iba1 and anti-CD68 antibodies), astrocytes (GFAP) and the anti-CB 2 R antibody was performed on brain slices from arcAβ mice 17 months of age. Autoradiography using the CB 2 R imaging probes [ 18 F]RoSMA-18-d6, [ 11 C]RSR-056 and [ 11 C]RS-028 and mRNA analysis were performed in brain tissue from arcAβ and nontransgenic littermate (NTL) mice at 6, 17, and 24 months of age. Specific increased CB 2 R immunofluorescence intensities on the increased number of GFAP-positive astrocytes and Iba1-positive microglia were detected in the hippocampus and cortex of 17-month-old arcAβ mice compared to NTL mice. CB 2 R immunofluorescence was higher in the glial cells inside 6E10-positive amyloid-β deposits than peri-plaque with a low background. Ex vivo autoradiography showed that the binding of [ 18 F]RoSMA-18-d6 and [ 11 C]RSR-056 was comparable in arcAβ and NTL mice at 6, 17 and 24 months. The level of Cnr2 mRNA expression in the brain was not significantly different between arcAβ and NTL mice at 6, 17 or 24 months. In conclusion, we demonstrated pronounced specific increases in microglial and astroglial CB 2 R expression levels in a model of AD-related cerebral amyloidosis/AD mouse model, emphasizing CB 2 R as a suitable target for imaging neuroinflammation.

Abstract Emerging evidence indicates crosstalk between the brain and the hematopoietic system following cerebral ischemia. Here, we investigated metabolism and oxygenation in the spleen and spinal cord in a transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) mouse model that is widely used in focal cerebral ischemia research. Naïve, sham and tMCAO mice underwent positron emission tomography (PET) using [ 18 F]fluorodeoxyglucose (FDG) for assessing glucose metabolism and multispectral optoacoustic tomography (MSOT) assisted with quantitative model-based reconstruction and unmixing algorithms for accurate mapping of oxygenation patterns in the peripheral tissues at 24 h after reperfusion. We found increased levels of [ 18 F]FDG uptake and reduced MSOT oxygen saturation, indicating hypoxia in the thoracic spinal cord of tMCAO mice compared with sham-operated mice but not in the spleen. A positive correlation was observed between splenic and ipsilateral striatal [ 18 F]FDG uptake. Reduced spleen size was observed in tMCAO mice compared with sham-operated mice ex vivo . tMCAO led to a significant increase in the numbers of mature T cells (CD4 and CD8) in femoral bone marrow tissues, concomitant with a stark reduction in these cell subsets in the spleen and their decrease in peripheral blood. The numbers of mature granulocytes (determined as CD11b + Gr1 hi cells) decreased in bone marrow tissues and blood but increased in the spleen. The combination of quantitative PET and MSOT thus enabled the observation of hypoxia and increased metabolic activity in the spinal cord of tMCAO mice at 24 h after occlusion compared to sham-operated mice.