ABSTRACT Most of the biosynthetic gene clusters (BGCs) found in filamentous fungi are silent under standard laboratory cultivation conditions due to the lack of expression triggering stimuli, representing a considerable drawback in drug discovery. To access the full biosynthetic potential of these microbes, studies towards the activation of cryptic BGCs are essential. Histone acetylation status is an important regulator of chromatin structure which impacts in cell physiology and, therefore, expression of biosynthetic gene clusters in filamentous fungi. Histone deacetylases (HDACs) and histone acetyl-transferases (HATs) are responsible for maintaining and controlling this process under different cell conditions. In this study, clr3 , a gene encoding a histone deacetylase in Penicillium brasilianum was deleted and associated phenotypic and metabolic changes evaluated. Results indicate reduced growth under oxidative stress conditions in the Δ clr3 knockout strain. Also, the production of several secondary metabolites including austin-related meroterpenoids, brasiliamides, mycotoxins such as verruculogen and penicillic acid, as well as cyclodepsipeptides was reduced in the Δ clr3 strain when compared to wild-type strain. Accordingly, addition of epigenetic modulators responsible for HDAC inhibition such as suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and nicotinamide (NAA) to P. brasilianum growth media also culminated in reduction of secondary metabolite production. Mass Spectrometry Imaging (MSI) was applied to compare metabolite production and spatial distribution on the colony. Results suggest that Clr3 plays an important role in secondary metabolite biosynthesis in P. brasilianum , thus offering new strategies for regulation of natural product synthesis by assessing chromatin modification in P. brasilianum .

Abstract Aspergillus fumigatus is a major opportunistic fungal pathogen of immunocompromised and immunocompetent hosts. To successfully establish an infection, A. fumigatus needs to use host carbon sources, such as acetate, present in the body fluids and peripheral tissues. However, utilisation of acetate as a carbon source by fungi in the context of infection has not been investigated. This work shows that acetate is metabolised via different pathways in A. fumigatus and that acetate utilisation is under the regulatory control of a transcription factor (TF), FacB. A. fumigatus acetate utilisation is subject to carbon catabolite repression (CCR), although this is only partially dependent on the TF and main regulator of CCR CreA. The available extracellular carbon source, in this case glucose and acetate, significantly affected A. fumigatus virulence traits such as secondary metabolite secretion and cell wall composition, with the latter having consequences for resistance to oxidative stress, to anti-fungal drugs and to human neutrophil-mediated killing. Furthermore, deletion of facB significantly impaired the in vivo virulence of A. fumigatus in both insect and mammalian models of invasive aspergillosis. This is the first report on acetate utilisation in A. fumigatus and this work further highlights the importance of available host-specific carbon sources in shaping fungal virulence traits and subsequent disease outcome, and a potential target for the development of anti-fungal strategies. Importance Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen in humans. During infection, A. fumigatus is predicted to use host carbon sources, such as acetate, present in body fluids and peripheral tissues, to sustain growth and promote colonisation and invasion. This work shows that A. fumigatus metabolises acetate via different pathways, a process that is dependent on the transcription factor FacB. Furthermore, the type and concentration of the extracellular available carbon source were determined to shape A. fumigatus virulence determinants such as secondary metabolite secretion and cell wall composition. Subsequently, interactions with immune cells are altered in a carbon source-specific manner. FacB is required for A. fumigatus in vivo virulence in both insect and mammalian models of invasive aspergillosis. This is the first report that characterises acetate utilisation in A. fumigatus and highlights the importance of available host-specific carbon sources in shaping virulence traits and potentially subsequent disease outcome.

Abstract Aspergillus fumigatus is the main causative agent of invasive pulmonary aspergillosis (IPA), a severe disease that affects immunosuppressed patients worldwide. The fungistatic drug caspofungin is the second line therapy against IPA but has increasingly been used against clinical strains that are resistant to azoles, the first line antifungal therapy. In high concentrations, caspofungin induces a tolerance phenotype with partial reestablishment of fungal growth called caspofungin paradoxical effect (CPE), resulting from a change in the composition of the cell wall. An increasing number of studies has shown that different isolates of A. fumigatus exhibit phenotypic heterogeneity, including heterogeneity in their CPE response. To gain insights into the underlying molecular mechanisms of CPE response heterogeneity, we analyzed the transcriptomes of two A. fumigatus reference strains, Af293 and CEA17, exposed to low and high caspofungin concentrations. We found that there is a core transcriptional response that involves genes related to cell wall remodeling processes, mitochondrial function, transmembrane transport, and amino acid and ergosterol metabolism, and a variable response related to secondary metabolite (SM) biosynthesis and iron homeostasis. Specifically, we show here that the overexpression of a SM pathway that works as an iron chelator extinguishes the CPE in both backgrounds, whereas iron depletion is detrimental for the CPE in Af293 but not in CEA17. We next investigated the function of the transcription factor CrzA, whose deletion was previously shown to result in heterogeneity in the CPE response of the Af293 and CEA17 strains. We found that CrzA constitutively binds to and modulates the expression of several genes related to processes involved in caspofungin tolerance, and that crzA deletion differentially impacts the SM production and growth of Af293 and CEA17. As opposed to the Δ crzA CEA17 mutant, the Δ crzA Af293 mutant fails to activate cell wall remodeling genes upon caspofungin exposure, which most likely severely affects its macrostructure and extinguishes its CPE. This work describes how heterogeneity in the response to an antifungal agent between A. fumigatus strains stems from heterogeneity in the function of a transcription factor and its downstream target genes.

Abstract In Cystic Fibrosis (CF), mucus plaques are formed in the patient’s lung, creating a hypoxic condition and a propitious environment for colonization and persistence of many microorganisms. There is clinical evidence showing that Aspergillus fumigatus can co-colonize CF patients with Pseudomonas aeruginosa , which has been associated with lung function decline. P. aeruginosa produces several compounds with inhibitory and anti-biofilm effects against A. fumigatus in vitro; however, little is known about the fungal compounds produced in counterattack. Here, we annotated fungal and bacterial secondary metabolites (SM) produced in mixed biofilms in normoxia and hypoxia conditions. We detected nine SMs produced by P. aeruginosa . Phenazines and different analogs of pyoverdin were the main compounds produced by P. aeruginosa , and their secretion were increased by the fungal presence. The roles of the two operons responsible for phenazines production ( phzA1 and phzA2 ) were also investigated showing both mutants are able to produce partial sets of phenazines. We detected a total of 20 SMs secreted by A. fumigatus either in monoculture or in co-culture with P. aeruginosa . All these compounds are secreted during biofilm formation either in normoxia or hypoxia. However, only eight compounds (demethoxyfumitremorgin C, fumitremorgin, ferrichrome, ferricrocin, tricetylfusigen, gliotoxin, gliotoxin E, and pyripyropene A) were detected during the biofilm formation by the co-culture of A. fumigatus and P. aeruginosa upon both normoxia and hypoxia conditions. Overall, we showed how diverse is SM secretion during A. fumigatus and P. aeruginosa mixed culture and how this can affect biofilm formation both in normoxia and hypoxia. Author Summary The interaction between Pseudomonas aeruginosa and Aspergillus fumigatus has been well-characterized in vitro . In this scenario, the bacterium exerts a strong inhibitory effect against the fungus. However, little is known about the metabolites produced by the fungus to counterattack the bacteria. Our work aimed to annotate secondary metabolites (SM) secreted during co-culture between P. aeruginosa and A. fumigatus during biofilm formation in both normoxia and hypoxia. The bacterium produces several different types of phenazines and pyoverdins, in response to the fungus presence. In contrast, we were able to annotate 29 metabolites produced during A. fumigatus biofilm formation but only eight compounds were detected during biofilm formation by the co-culture of A. fumigatus and P. aeruginosa upon both normoxia and hypoxia. In conclusion, we have detected many SMs secreted during A. fumigatus and P. aeruginosa biofilm formation. This analysis can provide several opportunities to understand the interaction between these two species.

ABSTRACT Penicillium digitatum is the most aggressive pathogen of citrus fruits. Tryptoquialanines are major indole alkaloids produced by P. digitatum . It is unknown if tryptoquialanines are involved in the damage of citrus fruits caused by P. digitatum . To investigate the pathogenic roles of tryptoquialanines, we initially asked if tryptoquialanines could affect the germination of Citrus sinensis seeds. Exposure of the citrus seeds to tryptoquialanine A resulted in a complete inhibition of germination and an altered metabolic response. Since this phytotoxic effect requires the extracellular export of tryptoquialanine A, we investigated the mechanisms of extracellular delivery of this alkaloid in P. digitatum . We detected extracellular vesicles (EVs) released by P. digitatum both in culture and during infection of citrus fruits. Compositional analysis of EVs produced during infection revealed the presence of a complex cargo, which included tryptoquialanines and the mycotoxin fungisporin. The EVs also presented phytotoxicity activity in vitro , and caused damage to the tissues of citrus seeds. Through molecular networking, it was observed that the metabolites present in the P. digitatum EVs are produced in all of its possible hosts. Our results reveal a novel phytopathogenic role of P. digitatum EVs and tryptoquialanine A, implying that this alkaloid is exported in EVs during plant infection. IMPORTANCE During the post-harvest period, citrus fruits can be affected by phytopathogens such as Penicillium digitatum , which causes the green mold disease and is responsible for up to 90 % of the total citrus losses. Chemical fungicides are widely used to prevent the green mold disease, leading to concerns about environmental and health risks. To develop safer alternatives to control phytopathogens, it is necessary to understand the molecular basis of infection during the host-pathogen interaction. In the P. digitatum model, the virulence strategies are poorly known. Here, we describe the production of phytotoxic extracellular vesicles (EVs) by P. digitatum during the infection of citrus fruits. We also characterized the secondary metabolites in the cargo of EVs and found in this set of molecules an inhibitor of seed germination. Since EVs and secondary metabolites have been related to virulence mechanisms in other host-pathogen interactions, our data are important for the comprehension of how P. digitatum causes damage to its primary hosts.

Abstract Small molecules are components of fungal extracellular vesicles (EVs), but their biological roles are only superficially known. NOP16 is a eukaryotic gene that is required for the activity of benzimidazoles against Cryptococcus deuterogattii . In this study, during the phenotypic characterization of C. deuterogattii mutants lacking NOP16 expression, we observed that this gene was required for EV production. Analysis of the small molecule composition of EVs produced by wild-type cells and two independent nop16 Δ mutants revealed that the deletion of NOP16 resulted not only in a reduced number of EVs but also an altered small molecule composition. In a Galleria mellonella model of infection, the nop16 Δ mutants were hypovirulent. The hypovirulent phenotype was reverted when EVs produced by wild-type cells, but not mutant EVs, were co-injected with the nop16 Δ cells in G. mellonella . These results reveal a role for NOP16 in EV biogenesis and cargo, and also indicate that the composition of EVs is determinant for cryptococcal virulence.

Abstract G-protein coupled receptors (GPCRs) are extracellular signalling receptors that sense environmental cues to coordinate a biological response. Fungi sense their environment primarily through GPCR-mediated signalling pathways, which in turn regulate fungal development, metabolism, virulence and mycotoxin biosynthesis. A. fumigatus is an important human pathogen that causes aspergillosis, a heterogeneous group of diseases that presents a wide range of clinical manifestations. Here, we investigate in detail the role of the GPCRs GprM and GprJ in growth and gene expression. GprM and GprJ are important for melanin production and the regulation of the cell wall integrity (CWI) pathway. Overexpression of gprM and gprJ causes a 20 and 50% reduction in growth rate when compared to the wild-type (WT) strain, and increases sensitivity to cell wall-damaging agents. Phosphorylation of the CWI protein kinase MpkA is increased in the Δ gprM and Δ gprJ strains and decreased in the overexpression mutants when compared to the WT strain. Furthermore, differences in cell wall polysaccharide concentrations and organization were observed in these strains. RNA-sequencing suggests that GprM and GprJ negatively regulate genes encoding secondary metabolites (SMs). Mass spectrometry analysis confirmed that the production of fumagillin, pyripyropene, fumigaclavine C, fumiquinazoline, and fumitremorgin is reduced in the Δ gprM and Δ gprJ strains, and that this regulation occurs, at least partially, through the activation of MpkA. Overexpression of grpM also resulted in the regulation of many transcription factors, with AsgA predicted to function downstream of GprM and MpkA signalling. Finally, we show that the Δ gprM and Δ gprJ mutants are reduced in virulence in the Galleria mellonella insect model of invasive aspergillosis. This work further contributes to unravelling functions of A. fumigatus GPCRs and shows that GprM and GprJ are essential for CWI, secondary metabolite production and virulence. Author summary A. fumigatus is the main ethiological agent of invasive pulmonary aspergillosis, a life-threatening fungal disease that occurs in severely immuno-compromised humans. Withstanding the host environment is essential for A. fumigatus virulence and sensing of extracellular cues occurs primarily through G-protein coupled receptors (GPCRs) that activate signal transduction pathways, which in turn regulate fungal development, metabolism, virulence and mycotoxin biosynthesis. The A. fumigatus genome encodes 15 putative classical GPCRs, with only three having been functionally characterized to date. In this work, we show that the two GPCRs GprM and GprJ regulate the phosphorylation of the mitogen-activated protein kinase MpkA and thus control the regulation of the cell wall integrity pathway. GprM and GprJ are also involved in the regulation of the production of the secondary metabolites fumagillin, pyripyropene, fumigaclavine C, fumiquinazoline, melanin, and fumitremorgin and this regulation partially occurs through the activation of MpkA. Furthermore, GprM and GprJ are important for virulence in the insect model Galleria mellonella . This work therefore functionally characterizes two GPCRs and shows how they regulate several intracellular pathways that have been shown to be crucial for A. fumigatus virulence.

Abstract The unexplored saline lagoons of the north of Peru harbor a rich microbiome, due to reported studies of different extreme environments around the world. In these regions, there are several ecosystems and microhabitats not yet explored, and little is known about the diversity of actinobacteria and other microorganisms. We suggest that the endemic bacteria present in this extreme environment could be source of active molecules with anticancer, antimicrobial, antiparasitic properties. Using phenotypic and genotypic characterization techniques including the 16S rRNA were identified into the genera Streptomyces 39 (78%), Pseudonocardia 3 (6%), Staphylococcus 4 (8%), Bacillus 2 (4%), and Pseudomonas 2 (4%). All isolated bacteria for the genotypic data were preliminarily identified. Actinobacteria strains were found dominantly in both sites (Lagoon1-3 = 16 isolates and lagoon 4 = 12 isolates). Phylogenetic analysis revealed that 28 isolates were exclusively affiliated to eleven different clusters of Actinobacteria of the major genus Streptomyces . Three Streptomyces sp. strains M-92, B-146, and B-81, were tested for antibacterial and antiproliferative activities. The results showed antiproliferative activities against three tumor cell lines, U251 glioma; MCF7 breast; NCI-H460 lung non-small type of cells, and the antibacterial activity to Staphylococcus aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 10536, and Acinetobacter baumanni AC-972 which is resistant to multiple drugs. The promising results belong to Streptomyces sp. B-81 strain in the R2A medium using a doxorubicin with control positive, the best result was from the latter (TGI = 0,57 µg/mL) for glioma; NCI-H460 lung of type non-small cells (TGI = 0,61 µg/mL), and breast cancer (TGI =0,80 µg/mL), this strain was selected to be fractionated because it had better antiproliferative and antibacterial activity, and its fractions were evaluated concerning antiproliferative activity against nine types of tumor cells and one non-tumor. The methanolic fraction showed a better result in the antiproliferative activity and was able to inhibit U251 (glioma) (TGI = 38.3 µg/mL), OVCAR-03 (ovary) (TGI = 62.1 µg/mL), and K562 (leukemia) (TGI = 81.5 µg/mL). The methanol 50% - acetate 50% fraction (Fraction 4) inhibited U251 (glioma) (TGI = 73.5 µg/mL) and UACC-62 (melanoma) (TGI = 89.4 µg/mL). Moreover, the UHPLC-MS/MS data and molecular networking of Streptomyces sp . B-81 isolate extract revealed the production cholic acid, Lobophorin A, Lobophorin B, Lobophorin E, Lobophorin K and compound 6. Extremophilic environments such as the Mórrope and Bayovar Salt Flats are promising sources of new bacteria with promising pharmaceutical potential; These compounds could be useful to treat various infectious diseases or even some type of cancer.

Abstract Protein acetylation is a crucial post-translational modification that controls gene expression and a variety of biological processes. Sirtuins, a prominent class of NAD + -dependent lysine deacetylases, serve as key regulators of protein acetylation and gene expression in eukaryotes. In this study, six single knockout strains of fungal pathogen Aspergillus fumigatus were constructed, in addition to a strain lacking all predicted sirtuins (SIRTKO). Phenotypic assays suggest that sirtuins are involved in cell wall integrity, secondary metabolite production, thermotolerance, and virulence. AfsirE deletion resulted in attenuation of virulence, as demonstrated in murine and Galleria infection models. The absence of AfSirE leads to altered acetylation status of proteins, including histones and non-histones, resulting in significant changes in the expression of genes associated with secondary metabolism, cell wall biosynthesis, and virulence factors. These findings encourage testing sirtuin inhibitors as potential therapeutic strategies to combat A. fumigatus infections or in combination therapy with available antifungals.

Abstract Understanding extremophiles and their usefulness in biotechnology involves studying their habitat, physiology and biochemical adaptations, as well as their ability to produce biocatalysts, in environments that are still poorly explored. In northwestern Peru, which has saline lagoons of marine origin Pacific Ocean, the other site is from the coast of Brazil of the Atlantic Ocean. Both environments are considered extreme. The objective of the present work was to compare two different strains isolated from these extreme environments at the metabolic level using molecular network methodology through the Global Natural Products Molecular Social Network (GNPS). In our study, the MS/MS spectra from the network were compared with GNPS spectral libraries, where the metabolites were annotated. Differences were observed in the molecular network presented in the two strains of Streptomyces spp. coming from these two different environments. Within the an-notated compounds from marine bacteria, the metabolites characterized for Streptomyces sp. B-81 from Peruvian marshes were lobophorins A (1) and H (2), as well as divergolides A (3), B (4) and C (5). Streptomyces sp. 796.1 produced different compounds, such as glucopiericidin A (6) and dehy-dro-piericidin A1a (7). The search for new metabolites in underexplored environments may therefore reveal new metabolites with potential application in different areas of biotechnology.