Replacement of the stalled replicative polymerase (Pol δ) at a DNA lesion by the error-prone DNA polymerase κ (Pol κ) restarts synthesis past the lesion to prevent genome instability. The switching from Pol δ to Pol κ is mediated by the processivity clamp PCNA but the structural basis of this mechanism is unknown. We determined the Cryo-EM structures of human Pol κ–DNA–PCNA complex and of a stalled Pol δ–DNA–PCNA complex at 3.9 and 4.7 Å resolution, respectively. In Pol κ complex, the C-terminus of the PAD domain docks the catalytic core to one PCNA protomer in an angled orientation, bending the DNA exiting Pol κ active site through PCNA. In Pol δ complex, the DNA is disengaged from the active site but is retained by the thumb domain. We present a model for polymerase switching facilitated by Pol κ recruitment to PCNA and Pol κ conformational sampling to seize the DNA from stalled Pol δ assisted by PCNA tilting.

In eukaryotes, DNA polymerase δ (Pol δ) bound to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) replicates the lagging strand and cooperates with flap endonuclease 1 (FEN1) to process the Okazaki fragments for their ligation. We present the high-resolution cryo-EM structure of the human processive Pol δ-DNA-PCNA complex in the absence and presence of FEN1. Pol δ is anchored to one of the three PCNA monomers through the C-terminal domain of the catalytic subunit. The catalytic core sits on top of PCNA in an open configuration while the regulatory subunits project laterally. This arrangement allows PCNA to thread and stabilize the DNA exiting the catalytic cleft and recruit FEN1 to one unoccupied monomer in a toolbelt fashion. Alternative holoenzyme conformations reveal important functional interactions that maintain PCNA orientation during synthesis. This work sheds light on the structural basis of Pol δ activity in replicating the human genome.

Abstract A cell’s ability to survive and to evade cancer is contingent on its ability to retain genomic integrity, which can be seriously compromised when nucleic acid phosphodiester bonds are disrupted. DNA Ligase 1 (LIG1) plays a key role in genome maintenance by sealing single-stranded nicks that are produced during DNA replication and repair. Autosomal recessive mutations in a limited number of individuals have been previously described for this gene. Here we report a homozygous LIG1 mutation (p.A624T), affecting a universally conserved residue, in a patient presenting with leukopenia, neutropenia, lymphopenia, pan-hypogammaglobulinemia, and diminished in vitro response to mitogen stimulation. Patient fibroblasts expressed normal levels of LIG1 protein but exhibited impaired growth, poor viability, high baseline levels of gamma-H2AX foci, and an enhanced susceptibility to DNA-damaging agents. The mutation reduced LIG1 activity by lowering its affinity for magnesium 2.5-fold. Remarkably, it also increased LIG1 fidelity > 50-fold against 3’ end 8-Oxoguanine mismatches, exhibiting a marked reduction in its ability to process such nicks. This is expected to yield increased ss- and dsDNA breaks. Molecular dynamic simulations, and Residue Interaction Network studies, predicted an allosteric effect for this mutation on the protein loops associated with the LIG1 high-fidelity magnesium, as well as on DNA binding within the adenylation domain. These dual alterations of suppressed activity and enhanced fidelity, arising from a single mutation, underscore the mechanistic picture of how a LIG1 defect can lead to severe immunological disease.

Single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) has become an essential structural determination technique with recent hardware developments making it possible to reach atomic resolution, at which individual atoms, including hydrogen atoms, can be resolved. In this study, we used the enzyme involved in the penultimate step of riboflavin biosynthesis as a test specimen to benchmark a recently installed microscope and determine if other protein complexes could reach a resolution of 1.5 Å or better, which so far has only been achieved for the iron carrier ferritin. Using state-of-the-art microscope and detector hardware as well as the latest software techniques to overcome microscope and sample limitations, a 1.42 Å map of Aquifex aeolicus lumazine synthase (AaLS) was obtained from a 48 h microscope session. In addition to water molecules and ligands involved in the function of AaLS, we can observe positive density for ∼50% of the hydrogen atoms. A small improvement in the resolution was achieved by Ewald sphere correction which was expected to limit the resolution to ∼1.5 Å for a molecule of this diameter. Our study confirms that other protein complexes can be solved to near-atomic resolution. Future improvements in specimen preparation and protein complex stabilization may allow more flexible macromolecules to reach this level of resolution and should become a priority of study in the field.

Abstract Single particle Cryo-Electron microscopy (Cryo-EM) has become an essential structural determination technique with recent hardware developments making it possible to reach atomic resolution at which individual atoms, including hydrogen atoms, can be resolved. Thus Cryo-EM allows not only unprecedented detail regarding the structural architecture of complexes but also a better understanding surrounding their chemical states. In this study we used the enzyme involved in the penultimate step of riboflavin biosynthesis as a test specimen to benchmark a recently installed microscope and determine if other protein complexes could reach a resolution of 1.5Å or better which so far has only been achieved for the iron carrier ferritin. Using state of the art microscope and detector hardware as well as the latest software techniques to overcome microscope and sample limitations, a 1.42Å map of Aquifex aeolicus lumazine synthase (AaLS) was obtained from a 48-hour microscope session. In addition to water molecules and ligands involved in AaLS function, we can observe positive density for ∼50% of hydrogen atoms. A small improvement in resolution was achieved by Ewald sphere correction which was expected to limit the resolution to ∼1.5Å for a molecule of this diameter. Our study confirms that other protein complexes can be solved to near-atomic resolution. Future improvements in specimen preparation and protein complex stabilization may allow more flexible macromolecules to reach this level of resolution and should become a priority of study in the field.

Ring-shaped hexameric helicases are nucleotide hydrolases that unwind double-stranded DNA into single strands, a necessary step in DNA replication. Critical to understanding their function are two outstanding questions: the location of DNA strand separation within the helicase, particularly at the onset of unwinding, and the precise dynamic linkage between nucleotide hydrolysis and DNA translocation. We explored these questions by employing cryo-EM to visualize the translocation mechanics of a AAA+ helicase (the SV40 Large Tumor Antigen, LTag) on forked DNA. We find the DNA fork nexus is positioned deep within the core helicase domain, with each DNA-binding loop from the six subunits securing the tracking strand by forming a paired staircase spiral which substitutes the passive strand. This structure forges an internal separation wedge, channeling the passive strand through a gap in the subunit C-tiers at the back of the helicase. Via cryo-EM continuous heterogeneity analysis we capture, and exhaustively model, a seamless spectrum of conformations of translocating LTag with near-atomic precision. ATP hydrolysis at the tightest inter-subunit interface operates like an 'entropy switch', triggering coordinated rigid-body rotations of the subunit C-tiers and DNA-binding loops, resulting in directional escorting of the tracking strand within the central channel, concomitantly setting preparatory steps for cycle restart. Overall, we demonstrate a dynamic model for hydrolysis-coupled translocation and internal DNA unwinding by a model helicase active in replication, and potentially during initial origin melting. Structural conservation of core helicase domains suggests the mechanism may be applicable to hexameric helicases across species.

Abstract Sliding clamps like PCNA are crucial processivity factors for replicative polymerases, requiring specific clamp loaders for loading onto DNA. The clamp loader CTF18 interacts with the leading strand polymerase Pol ε and loads PCNA onto primer/template DNA using its RFC pentameric module. Here, we provide a structural characterization of the human CTF18 complex and its interaction with PCNA. Our cryo-EM data support that the Ctf8 and Dcc1 subunits of CTF18, which form the regulatory module interacting with Pol ε, are flexibly tethered to the RFC module. A 2.9 Å cryo-EM structure shows the RFC module bound to PCNA in an auto-inhibited conformation similar to the canonical RFC loader, marking the initial step of the clamp-loading reaction. The unique RFC1 large subunit of CTF18, which shows high relative mobility, is anchored to PCNA through an atypical low-affinity PIP box in the AAA+ domain and engages the RFC5 subunit using a novel β-hairpin at the disordered N-terminus. These dual interactions may allow CTF18 RFC1 to outcompete the canonical RFC1 subunit while recycling the RFC2-3-4-5 subunits. Our results suggest that CTF18 comprises two structurally independent modules that cooperate in loading PCNA onto the leading strand for replication by Pol ε.