ABSTRACT Clostridium difficile infection (CDI) causes nearly half a million cases of diarrhea and colitis in the United States each year. Although the importance of the gut microbiota in C. difficile pathogenesis is well recognized, components of the human gut flora critical for colonization resistance are not known. Culture-independent high-density Roche 454 pyrosequencing was used to survey the distal gut microbiota for 39 individuals with CDI, 36 subjects with C. difficile -negative nosocomial diarrhea (CDN), and 40 healthy control subjects. A total of 526,071 partial 16S rRNA sequence reads of the V1 to V3 regions were aligned with 16S databases, identifying 3,531 bacterial phylotypes from 115 fecal samples. Genomic analysis revealed significant alterations of organism lineages in both the CDI and CDN groups, which were accompanied by marked decreases in microbial diversity and species richness driven primarily by a paucity of phylotypes within the Firmicutes phylum. Normally abundant gut commensal organisms, including the Ruminococcaceae and Lachnospiraceae families and butyrate-producing C2 to C4 anaerobic fermenters, were significantly depleted in the CDI and CDN groups. These data demonstrate associations between the depletion of Ruminococcaceae , Lachnospiraceae , and butyrogenic bacteria in the gut microbiota and nosocomial diarrhea, including C. difficile infection. Mechanistic studies focusing on the functional roles of these organisms in diarrheal diseases and resistance against C. difficile colonization are warranted.

Abstract Background Bacterial spot of pepper (BSP), caused by four different Xanthomonas species, primarily X. euvesicatoria (Xe) , poses a significant challenge in pepper cultivation. Host resistance is considered the most important approach for BSP control, offering long-term protection and sustainability. While breeding for resistance to BSP for many years focused on dominant R genes, introgression of recessive resistance has been a more recent focus of breeding programs. The molecular interactions underlying recessive resistance remain poorly understood. Results In this study, transcriptomic analyses were performed to elucidate defense responses triggered by Xe race P6 infection by two distinct pepper lines: the Xe -resistant line ECW50R containing bs5 , a recessive resistance gene that confers resistance to all pepper Xe races, and the Xe -susceptible line ECW. The results revealed a total of 3357 upregulated and 4091 downregulated genes at 0, 1, 2, and 4 days post-inoculation (dpi), with the highest number of differentially expressed genes (DEGs) observed at 2 dpi. Pathway analysis highlighted DEGs in key pathways such as plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway, plant hormone signal transduction, and photosynthesis – antenna proteins, along with cysteine and methionine metabolism. Notably, upregulation of genes associated with PAMP-Triggered Immunity (PTI) was observed, including components like FLS2, Ca-dependent pathways, Rboh, and reactive oxygen species (ROS) generation. In support of these results, infiltration of ECW50R leaves with bacterial suspension of Xe led to observable hydrogen peroxide accumulation without a rapid increase in electrolyte leakage, suggestive of the absence of Effector-Triggered Immunity (ETI). Furthermore, the study confirmed that bs5 does not disrupt the effector delivery system, as evidenced by incompatible interactions between avirulence genes and their corresponding dominant resistant genes in the bs5 background. Conclusion Overall, these findings provide insights into the molecular mechanisms underlying bs5 -mediated resistance in pepper against Xe and suggest a robust defense mechanism in ECW50R, primarily mediated through PTI. Given that bs5 provides early strong response for resistance, combining this resistance with other dominant resistance genes will enhance the durability of resistance to BSP.

Abstract Quickly understanding the genomic changes that lead to pathogen emergence is necessary to launch mitigation efforts and reduce harm. Often the evolutionary events that result in an epidemic typically remain elusive long after an outbreak, which is particularly true for plant pathogens. To rapidly define the consequential evolutionary events result in pathogen emergence, we tracked in real-time a 2022 bacterial plant disease outbreak in US geranium ( Pelargonium x hortorum ) caused by Xhp2022, a novel lineage of Xanthomonas hortorum . Genomes from 31 Xhp2022 isolates from seven states showed limited chromosomal variation, and all contained a single plasmid (p93). Time tree and SNP whole genome analysis estimated that Xhp2022 emerged in the early 2020s. Phylogenomic analysis determined that p93 resulted from cointegration of three plasmids (p31, p45, and p66) present in a 2012 outbreak. p31, p45 and p66 were individually found in varying abundance across X. hortorum isolates from historical outbreaks dating to 1974 suggesting these plasmids were maintained in the broader metapopulation. p93 specifically arose from two co-integration events from homologous and Tn 3 and XerC-mediated site-specific recombination. Although p93 suffered a 49kb nucleotide reduction, it maintained critical fitness gene functions encoding, for example, metal resistance and virulence factors, which were likely selected by the ornamental production system. Overall we demonstrate how rapid sequencing of current and historical isolates track the evolutionary history of an emerging, ongoing threat. We show a recent, tractable event of genome reduction for niche adaptation typically observed over millenia in obligate and fastidious pathogens. Significance Genome-resolved epidemiology is rapidly changing how we track pathogens in real-time to support stakeholders and health. This research highlights how we responded to a current disease outbreak of geranium. Our work revealed that a new group of the bacterial plant pathogen Xanthomonas horotrum emerged in 2022 as a result of a recent genome reduction. We determined that three distinct plasmids were present in the broader X. hortorum metapopulation since 1974. In 2012, the three plasmids were altogether present in individual isolates; then in 2022, all three plasmids co-integrated while maintaining critical fitness genes but losing extraneous genomic material. This parallels genome efficiency and reduction that we see across millenia or even millions of years with obligate parasites with increased niche-specificity.

Abstract Tomato is a high value crop that requires quality seed each season. Tomato production often relies on international breeding and production chains with a global network to deliver seeds to growers. Xanthomonas perforans , one of the causal agents of bacterial spot of tomato, is seedborne and has rapidly emerged and displaced other bacterial spot xanthomonads in tomato production regions around the world. The objectives of this work were to determine if different tomato production regions contain genetically distinct X. perforans populations, examine genetic relatedness of strains collected in tomato seed production areas in East Asia and other production regions, estimate the timing of X. perforans population expansion relative to its first report in 1991, and evaluate variation in type III effectors, which are critical pathogenicity and virulence factors. Our results showed extensive genetic diversity in the pathogen and highly similar strains in distant tomato production regions, which is consistent with global dissemination. Furthermore, we found genetically similar strains in tomato seed production and fruit production regions, as would be expected if the pathogen was being moved through tomato production chains from a common origin. We found waves of diversification of populations in the United States, where our sampling was more extensive, before and since its first detection, consistent with emergence of new X. perforans genotypes from diverse source populations. Variation in gene content, including effector genes, within and between core genome lineages suggests the potential for rapid changes to the accessory genome upon dissemination. Evolution of the X. perforans pangenome, including the acquisition and loss of type III secreted effectors, will continue to challenge sustainable management of tomato bacterial spot.

Abstract Bacterial spot caused by Xanthomonas euvesicatoria is a major disease of pepper ( Capsicum annuum L.) in warm and humid production environments. Use of genetically resistant cultivars is an effective approach to manage bacterial spot. Two recessive resistance genes, bs5 and bs6 , confer non-race-specific resistance against bacterial spot. The objective of our study was to map these two loci in the pepper genome. We used a genotyping-by-sequencing approach to initially map the position of the two resistances. Segregant populations for bs5 and bs6 were developed by crossing susceptible Early CalWonder (ECW) with near-isogenic lines ECW50R ( bs5 introgression) or ECW60R ( bs6 introgression). Following fine-mapping, bs5 was delimited to a ~535 Kbp interval on chromosome 3, and bs6 to a ~666 Kbp interval in chromosome 6 of pepper. We also identified 14 and 8 candidate resistance genes for bs5 and bs6 , respectively, based on predicted protein coding polymorphisms between ECW and the corresponding resistant parent. Mapping of bs5 and bs6 will facilitate their use in breeding programs through marker-assisted selection and is also a crucial step towards understanding the mechanisms of resistance. Key message Two recessive bacterial spot resistance genes were mapped in the pepper genome, which will facilitate their advancement in commercial pepper for management of all races of Xanthomonas euvesicatoria .