Abstract TonB-dependent transporters (TBDTs) mediate outer membrane transport of nutrients using the energy derived from proton motive force transmitted from the TonB−ExbB−ExbD complex localized in the inner membrane. Recently, we discovered ddvT encoding a TBDT responsible for the uptake of a 5,5-type lignin-derived dimer in Sphingobium sp. strain SYK-6. Furthermore, overexpression of ddvT in an SYK-6-derivative strain enhanced its uptake capacity, improving the rate of platform chemical production. Thus, understanding the uptake system of lignin-derived aromatics is fundamental for microbial conversion-based lignin valorization. Here we examined whether multiple tonB -, exbB -, and exbD -like genes in SYK-6 contribute to the outer membrane transport of lignin-derived aromatics. The disruption of tonB2 − 6 and exbB3 did not reduce the capacity of SYK-6 to convert or grow on lignin-derived aromatics. In contrast, the introduction of the tonB1 − exbB1 − exbD1 − exbD2 operon genes into SYK-6, which could not be disrupted, promoted the conversion of β-O-4-, β-5-, β-1-, β-β-, and 5,5-type dimers and monomers, such as ferulate, vanillate, syringate, and protocatechuate. These results suggest that TonB-dependent uptake involving the tonB1 operon genes is responsible for the outer membrane transport of the above aromatics. Additionally, exbB2 / tolQ and exbD3 / tolR were suggested to constitute the Tol-Pal system that maintains the outer membrane integrity.

For the direct alkaline oxidation of rice husk lignin, we developed a copper foam-based heterogeneous catalyst that offers advantages in its recovery after the reaction mixture. The depolymerized products were utilized for muconate production by an engineered Pseudomonas sp. NGC7-based strain. A hydroxide nanorod-modified copper foam was prepared by the surface oxidation of copper foam, followed by alkaline oxidation of rice husk lignin over the catalyst. The catalyst was easily separated from the cellulosic residues in the reaction mixture, and the residues were then recovered by filtration. The resulting lignin stream was composed of a variety of aromatic monomers containing p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl compounds. The catabolic activity of Pseudomonas sp. NGC7 was demonstrated to be more suitable for muconate production from a mixture comprising 4-hydroxybenzoate (a typical p-hydroxyphenyl compound), vanillate (a guaiacyl compound), and syringate (a syringyl compound), owing to its natural ability to grow on syringate. Thus, it was applied to produce muconate from a rice husk lignin stream prepared through hydroxide nanorod-modified copper foam-catalyzed alkaline oxidation by conferring the genes responsible for converting the acetophenone derivatives to their corresponding aromatic acids and protocatechuate decarboxylase to an NGC7-based strain deficient in protocatechuate 3,4-dioxygenase and muconate cycloisomerase. As a result, the engineered NGC7-based muconate-producing strain produced muconate selectively from the rice husk lignin stream at 93.7 mol% yield.

Abstract Lignin contains a variety of interunit linkages, which leads to a range of potential decomposition products that can be used as carbon sources by microbes. β-O-4 linkages are the most common in native lignin and associated catabolic pathways have been well characterized. However, the fate of the mono-aromatic intermediates that result from β-O-4 dimer cleavage has not been fully elucidated. Here, we used experimental evolution to identify mutant strains of Novosphingobium aromaticivorans with improved catabolism of a model aromatic dimer containing a β-O-4 linkage, guaiacylglycerol-β-guaiacyl ether (GGE). We identified several parallel causal mutations, including a single nucleotide mutation in the promoter of an uncharacterized gene that roughly doubled the growth yield with GGE. We characterized the associated enzyme and demonstrated that it oxidizes an intermediate in GGE catabolism, β-hydroxypropiovanillone, to vanilloyl acetaldehyde. Identification of this enzyme and its key role in GGE catabolism furthers our understanding of catabolic pathways for lignin-derived aromatic compounds. Importance Lignin degradation is a key step for both carbon cycling in nature and biomass conversion to fuels and chemicals. Bacteria can catabolize lignin-derived aromatic compounds, but the complexity of lignin means that full mineralization requires numerous catabolic pathways and often results in slow growth. Using experimental evolution, we identified a new enzyme for catabolism of a lignin-derived aromatic monomer, β-hydroxypropiovanillone. A single mutation in the promoter of the associated gene significantly increased bacterial growth with either β-hydroxypropiovanillone or a related lignin-derived aromatic dimer. This work expands the repertoire of known aromatic catabolic genes and demonstrates that slow catabolism of lignin-derived aromatic compounds may be due to misregulation under laboratory conditions rather than inherent catabolic challenges.

ABSTRACT Acetovanillone is a major aromatic monomer produced in oxidative/base-catalyzed lignin depolymerization. However, the production of chemical products from acetovanillone has not been explored due to the lack of information on the microbial acetovanillone catabolic system. Here acvABCDEF was identified as specifically induced genes during the growth of Sphingobium sp. strain SYK-6 cells with acetovanillone and these genes were essential for SYK-6 growth on acetovanillone and acetosyringone (a syringyl-type acetophenone derivative). AcvAB and AcvF produced in Escherichia coli phosphorylated acetovanillone/acetosyringone and dephosphorylated the phosphorylated acetovanillone/acetosyringone, respectively. AcvCDE produced in Sphingobium japonicum UT26S converted the dephosphorylated phosphorylated acetovanillone/acetosyringone intermediate into vanilloyl acetic acid/3- (4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3-oxopropanoic acid through carboxylation. To demonstrate the feasibility of producing cis , cis -muconic acid from acetovanillone, a metabolic modification on a mutant of Pseudomonas sp. strain NGC7 that accumulates cis , cis -muconic acid from catechol was performed. The resulting strain expressing vceA and vceB required for converting vanilloyl acetic acid to vanillic acid and aroY encoding protocatechuic acid decarboxylase in addition to acvABCDEF successfully converted 1.2 mM acetovanillone to approximate equimolar cis , cis -muconic acid. Our results are expected to help improve the yield and purity of value-added chemical production from lignin through biological funneling. IMPORTANCE In the alkaline oxidation of lignin, aromatic aldehydes (vanillin, syringaldehyde, and p -hydroxybenzaldehyde), aromatic acids (vanillic acid, syringic acid, and p - hydroxybenzoic acid), and acetophenone-related compounds (acetovanillone, acetosyringone, and 4’-hydroxyacetophenone) are produced as major aromatic monomers. Also, base-catalyzed depolymerization of guaiacyl lignin resulted in vanillin, vanillic acid, guaiacol, and acetovanillone as primary aromatic monomers. To date, microbial catabolic systems of vanillin, vanillic acid, and guaiacol have been well characterized, and the production of value-added chemicals from them has also been explored. However, due to the lack of information on the microbial acetovanillone and acetosyringone catabolic system, chemical production from acetovanillone and acetosyringone has not been achieved. This is the first study to elucidate the acetovanillone/acetosyringone catabolic system, and to demonstrate the potential of using these genes for value-added chemicals production from these compounds.

Iron, an essential element for all organisms, acts as a cofactor of enzymes in bacterial degradation of recalcitrant aromatic compounds. The bacterial family, Sphingomonadaceae comprises various degraders of recalcitrant aromatic compounds; however, little is known about their iron acquisition system. Here, we investigated the iron acquisition system in a model bacterium capable of degrading lignin-derived aromatics, Sphingobium sp. strain SYK-6. Analyses of SYK-6 mutants revealed that FiuA (SLG\_34550), a TonB-dependent receptor (TBDR), was the major outer membrane iron transporter. Three other TBDRs encoded by SLG\_04340, SLG\_04380, and SLG\_10860 also participated in iron uptake, and tonB2 (SLG\_34550), one of the six tonB comprising the Ton complex which enables TBDR-mediated transport was critical for iron uptake. The ferrous iron transporter FeoB (SLG\_36840) played an important role in iron uptake across the inner membrane. The promoter activities of most of the iron uptake genes were induced under iron-limited conditions, and their regulation is controlled by SLG_29410 encoding the ferric uptake regulator, Fur. Although feoB , among all the iron uptake genes identified is highly conserved in Sphingomonad strains, the outer membrane transporters seem to be diversified. Elucidation of the iron acquisition system promises better understanding of the bacterial degradation mechanisms of aromatic compounds.

ABSTRACT Sphingobium sp. strain SYK-6 is an alphaproteobacterial degrader of lignin-derived aromatic compounds, which can degrade all the stereoisomers of β-aryl ether-type compounds. SYK-6 cells convert four stereoisomers of guaiacylglycerol-β-guaiacyl ether (GGE) into two enantiomers of α-(2-methoxyphenoxy)-β-hydroxypropiovanillone (MPHPV) through GGE α-carbon atom oxidation by stereoselective Cα-dehydrogenases encoded by ligD, ligL , and ligN . The ether linkages of the resulting MPHPV enantiomers are cleaved by stereoselective glutathione S -transferases (GSTs) encoded by ligF, ligE , and ligP , generating (β R β S )-α-glutathionyl-β-hydroxypropiovanillone (GS-HPV) and guaiacol. To date, it has been shown that the gene products of ligG and SLG_04120 ( ligQ ), both encoding GST, catalyze glutathione removal from (β R β S )-GS-HPV, forming achiral β-hydroxypropiovanillone. In this study, we characterized the enzyme properties of LigG and LigQ and elucidated their roles in β-aryl ether catabolism. Purified LigG showed an approximately 300-fold higher specific activity for (β R )-GS-HPV than that for (β S )-GS-HPV, whereas purified LigQ showed an approximately six-fold higher specific activity for (β S )-GS-HPV than that for (β R )-GS-HPV. Analyses of mutants of ligG, ligQ , and both genes revealed that SYK-6 converted (β R )-GS-HPV using both LigG and LigQ, whereas only LigQ was involved in converting (β S )-GS-HPV. Furthermore, the disruption of both ligG and ligQ was observed to lead to the loss of the capability of SYK-6 to convert MPHPV. This suggests that GSH removal from GS-HPV catalyzed by LigG and LigQ, is essential for cellular GSH recycling during β-aryl ether catabolism. IMPORTANCE The β-aryl ether linkage is most abundant in lignin, comprising 45%–62% of all intermonomer linkages in lignin; thus, cleavage of the β-aryl ether linkage together with the subsequent degradation process is considered the essential step in lignin biodegradation. The enzyme genes for β-aryl ether cleavage are useful for decomposing high-molecular-weight lignin, converting lignin-derived aromatic compounds into value-added products, and modifying lignin structures in plants to reduce lignin recalcitrance. In this study, we uncovered the roles of the two glutathione S -transferase genes, ligG and ligQ , in the conversion of GS-HPV isomers, which are generated in the β-aryl ether cleavage pathway in SYK-6. Adding our current results to previous findings allowed us to have a whole picture of the β-aryl ether cleavage system in SYK-6.

ABSTRACT Syringate and vanillate are the major metabolites of lignin biodegradation. In Sphingobium sp. strain SYK-6, syringate is O demethylated to gallate by consecutive reactions catalyzed by DesA and LigM, and vanillate is O demethylated to protocatechuate by a reaction catalyzed by LigM. The gallate ring is cleaved by DesB, and protocatechuate is catabolized via the protocatechuate 4,5-cleavage pathway. The transcriptions of desA, ligM , and desB are induced by syringate and vanillate, while that of ligM and desB are negatively regulated by the MarR-type transcriptional regulator DesR, which is not involved in desA regulation. Here we clarified the regulatory system for desA transcription by analyzing the IclR-type transcriptional regulator desX , located downstream of desA . Quantitative reverse transcription (RT)-PCR analyses of a desX mutant indicates that the transcription of desA was negatively regulated by DesX. In contrast, DesX was not involved in the regulation of ligM and desB . The ferulate catabolic genes ( ferBA ) under the control of a MarR-type transcriptional regulator FerC are located upstream of desA . RT-PCR analyses suggest that the ferB - ferA -SLG_25010- desA gene cluster consists of the ferBA operon and the SLG_25010- desA operon. Promoter assays reveal that a syringate- and vanillate-inducible promoter is located upstream of SLG_25010. Purified DesX bound to this promoter region, which overlaps with an 18-bp-inverted repeat sequence that appears to be essential for the DNA binding of DesX. Syringate and vanillate inhibited the DNA binding of DesX, indicating that these compounds are effector molecules of DesX. IMPORTANCE Syringate is a major degradation product in the microbial and chemical degradation of syringyl lignin. Along with other low-molecular-weight aromatic compounds, syringate is produced by chemical lignin depolymerization. Converting this mixture into value-added chemicals using bacterial metabolism (i.e., biological funneling) is a promising option for lignin valorization. To construct an efficient microbial lignin conversion system, it is necessary to identify and characterize the genes involved in the uptake and catabolism of lignin-derived aromatic compounds and elucidate their transcriptional regulation. In this study, we found that the transcription of desA , encoding syringate O -demethylase in SYK-6, is regulated by an IclR-type of transcriptional regulator, DesX. The findings of this study, combined with our previous results on desR (a MarR transcriptional regulator that controls the transcription of ligM and desB ), provide an overall picture of the transcriptional regulatory systems for syringate and vanillate catabolism in SYK-6.

Lignin is a promising resource for obtaining aromatic materials, however, its heterogeneous structure poses a challenge for effective utilization. One approach to produce homogeneous aromatic materials from lignin involves the application of microbial catabolism, which is gaining attention. This current study focused on constructing a catabolic pathway in Pseudomonas sp. NGC7 to produce vanillate (VA) from aromatic compounds derived from the chemical depolymerization of sulfite lignin. Alkaline oxidation of sulfite lignin was performed using a hydroxide nanorod copper foam [Cu(OH)2/CF]-equipped flow reactor. The flow reactor operated continuously for 50 h without clogging and it yielded a sulfite lignin stream containing acetovanillone (AV), vanillin (VN), and VA as the major aromatic monomers. The catabolic pathway of Pseudomonas sp. NGC7 was optimized to maximize VA production from aromatic monomers in the sulfite lignin stream derived from this oxidation process. Pseudomonas sp. NGC7 possesses four gene sets for vanillate O-demethylase, comprising the oxygenase component (vanA) and its oxidoreductase component (vanB). Among these, the vanA4B4 gene set was identified as the key contributor to VA catabolism. To facilitate the conversion of AV to VA, AV-converting enzyme genes from Sphingobium lignivorans SYK-6 were introduced. The ΔvanA4B4 strain, harboring these AV-converting genes, produced VA from the sulfite lignin stream with 91 mol%. Further disruption of vanA1B1, vanA2B2, vanA3B3, and a vanillin reductase gene, in addition to vanA4B4, and introduction of a 5-carboxyvanillate decarboxylase gene from S. lignivorans SYK-6 to utilize 5-carboxyvanillin and 5-carboxyvanillate from the sulfite lignin stream for VA production achieved a VA yield of 103 mol%. Developing methods to overcome lignin heterogeneity is essential for its use as a raw material. Consolidating continuous alkaline oxidation of lignin in a Cu(OH)2/CF-packed flow reactor and biological funneling using an engineered catabolic pathway of Pseudomonas sp. NGC7 is a promising approach to produce VA for aromatic materials synthesis. NGC7 possesses a higher adaptability to various aromatic compounds generated from the alkaline oxidation of lignin and its natural ability to grow on p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl compounds underscores its potential as a bacterial chassis for VA production from a wide range of lignin-derived aromatic compounds.

ABSTRACT Sphingobium sp. SYK-6 is an efficient aromatic catabolic bacterium that can consume all four stereoisomers of 1,2-diguaiacylpropane-1,3-diol (DGPD), which is a ring-opened β-1-type dimer. Recently, LdpA-mediated catabolism of erythro -DGPD was reported in SYK-6, but the catabolic pathway for threo -DGPD was heretofore unknown. Here we elucidated the catabolism of threo -DGPD, which proceeds through conversion to erythro -DGPD. When threo -DGPD was incubated with SYK-6, the Cα alcohol groups of threo -DGPD (DGPD I and II) were initially oxidized to produce the Cα carbonyl form (DGPD-keto I and II). This initial oxidation step is catalyzed by Cα-dehydrogenases, which belong to the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) family and are involved in the catabolism of β-O-4-type dimers. Analysis of seven candidate genes revealed that NAD + -dependent LigD and LigL are mainly involved in the conversion of DGPD I and II, respectively. Next, we found that DGPD-keto I and II were reduced to erythro -DGPD (DGPD III and IV) in the presence of NADPH. Genes involved in this reduction were sought from Cα-dehydrogenase and ldpA -neighboring SDR genes. The gene products of SLG_12690 ( ldpC ) and SLG_12640 ( ldpB ) catalyzed the NADPH-dependent conversion of DGPD-keto I to DGPD III and DGPD-keto II to DGPD IV, respectively. Mutational analysis further indicated that ldpC and ldpB are predominantly involved in the reduction of DGPD-keto. Together, these results demonstrate that SYK-6 harbors a comprehensive catabolic enzyme system to utilize all four β-1-type stereoisomers through successive oxidation and reduction reactions of the Cα alcohol group of threo -DGPD with a net stereoinversion using multiple dehydrogenases. IMPORTANCE In many catalytic depolymerization processes of lignin polymers, aryl–ether bonds are selectively cleaved, leaving carbon–carbon bonds between aromatic units intact, including dimers and oligomers with β-1 linkages. Therefore, elucidating the catabolic system of β-1-type lignin-derived compounds will aid in the establishment of biological funneling of heterologous lignin-derived aromatic compounds to value-added products. In this work, we found that threo -DGPD was converted by successive stereoselective oxidation and reduction at the Cα-position by multiple alcohol dehydrogenases to erythro -DGPD, which is further catabolized. This system is very similar to that developed to obtain enantiopure alcohols from racemic alcohols by artificially combining two enantiocomplementary alcohol dehydrogenases. The results presented here demonstrate that SYK-6 has evolved to catabolize all four stereoisomers of DGPD by incorporating this stereoinversion system into its native β-1-type dimer catabolic system.

Bioconversion of lignin-rich streams requires microbial hosts capable of utilizing and tolerating heterogenous mixtures of monomeric and oligomeric compounds. Promising strains such as Novosphingobium aromaticivorans F199, N. aromaticivorans JMN2, Pseudomonas...