Objective

 Distant metastasis is the major cause of cancer-related death in patients with colorectal cancer (CRC). Although the microRNA-200 (miR-200) family is a crucial inhibitor of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in human cancer, the role of miR-200 members in the pathogenesis of metastatic CRC has not been investigated. 

Design

 Fifty-four pairs of primary CRC and corresponding matched liver metastasis tissue specimens were analysed for expression and methylation status of the miR-200 family members. Functional analysis of miR-200c overexpression was investigated in CRC cell lines, and cells were analysed for proliferation, invasion and migration. Expression of several miR-200c target genes (ZEB1, ETS1 and FLT1) and EMT markers (E-cadherin and vimentin) in CRC cell lines and tissue specimens was validated. 

Results

 Liver metastasis tissues showed higher expression of miR-200c (primary CRC=1.31 vs. liver metastasis=1.59; p=0.0014) and miR-141 (primary CRC=0.14 vs. liver metastasis=0.17; p=0.0234) than did primary CRCs, which was significantly associated with hypomethylation of the promoter region of these miRNAs (primary CRC=61.2% vs. liver metastasis=46.7%; p<0.0001). The invasive front in primary CRC tissues revealed low miR-200c expression by in situ hybridization analysis. Transfection of miR-200c precursors resulted in enhanced cell proliferation but reduced invasion and migration behaviours in CRC cell lines. Overexpression of miR-200c in CRC cell lines caused reduced expression of putative gene targets, and resulted in increased E-cadherin and reduced vimentin expression. The associations between miR-200c, target genes and EMT markers were validated in primary CRCs and matching liver metastasis tissues. 

Conclusions

 miR-200c plays an important role in mediating EMT and metastatic behaviour in the colon. Its expression is epigenetically regulated, and miR-200c may serve as a potential diagnostic marker and therapeutic target for patients with CRC.

microRNAs (miRNAs) play integral roles in diverse processes including tumorigenesis. miRNA gene loci are often found in close conjunction, and such clustered miRNA genes are transcribed from a common promoter to generate polycistronic primary transcript. The primary transcript (pri-miRNA) is then processed by two RNase III proteins to release the mature miRNAs. Although it has been speculated that the miRNAs in the same cluster may play related biological functions, this has not been experimentally addressed. Here we report that the miRNAs in two clusters (miR-106b approximately 93 approximately 25 and miR-222 approximately 221) suppress the Cip/Kip family members of Cdk inhibitors (p57(Kip2), p21(Cip1) and p27(Kip1)). We show that miR-25 targets p57 through the 3'-UTR. Furthermore, miR-106b and miR-93 control p21 while miR-222 and miR-221 regulate both p27 and p57. Ectopic expression of these miRNAs results in activation of Cdk2 and facilitation of G1/S phase transition. Consistent with these results, both clusters are abnormally upregulated in gastric cancer tissues compared to the corresponding normal tissues. Ectopic expression of miR-222 cluster enhanced tumor growth in the mouse xenograft model. Our study demonstrates the functional associations between clustered miRNAs and further implicates that effective cancer treatment may require a combinatorial approach to target multiple oncogenic miRNA clusters.

BackgroundThe oncogenic microRNAs (miRNAs) miR-21 and miR-31 negatively regulate tumor-suppressor genes. Their potential as serum biomarkers has not been determined in human colorectal cancer (CRC).

To evaluate the ability of epithelial-to-mesenchymal transition-related microRNAs (miRNAs) as serum biomarkers for prognosis and prediction of metastasis in patients with colorectal cancer (CRC).Epithelial-to-mesenchymal transition-related miRNAs drive CRC progression and metastasis. However, their potential as serum biomarkers in CRC has not been studied.This was a 3-phase study using 446 colorectal specimens. In the first phase, we selected candidate miRNAs associated with metastasis by analyzing the expression of 4 miR-200 family members (miR-200b, -200c, -141, and -429) in serum samples from 12 patients with stage I and IV CRC. The second phase involved independent validation of candidate miRNAs in serum from 182 patients with CRC and 24 controls. Finally, we analyzed expression in matched 156 tumor tissues from 182 patients with CRC and an independent set of 20 matched primary CRC and corresponding liver metastases to identify the source of circulating miRNAs.After initial screening, miR-200c was selected as the candidate serum miRNA best associated with metastasis. Validation analysis revealed that serum miR-200c levels were significantly higher in stage IV than in stage I-III CRCs. High serum miR-200c demonstrated a significant positive correlation with lymph node metastasis, distant metastasis, and prognosis (P = 0.0026, P = 0.0023, and P = 0.0064, respectively). More importantly, serum miR-200c was an independent predictor for lymph node metastasis (odds ratio: 4.81, 95% confidence interval: 1.98-11.7, P = 0.0005) and tumor recurrence (hazard ratio: 4.51, 95% confidence interval: 1.56-13.01, P = 0.005) and emerged as an independent prognostic marker for CRC (hazard ratio: 2.67, 95% confidence interval: 1.28-5.67, P = 0.01).Serum miR-200c has strong potential to serve as a noninvasive biomarker for CRC prognosis and predicting metastasis.

Objective

 Hypomethylation of LINE-1 elements has emerged as a distinguishing feature in human cancers. Limited evidence indicates that some LINE-1 elements encode an additional internal antisense promoter, and increased hypomethylation of this region may lead to inadvertent activation of evolutionarily methylation-silenced downstream genes. However, the significance of this fundamental epigenetic mechanism in colorectal cancer (CRC) has not been investigated previously. 

Design

 We analysed tissue specimens from 77 CRC patients with matched sets of normal colonic mucosa, primary CRC tissues (PC), and liver metastasis tissues (LM). LINE-1 methylation levels were determined by quantitative bisulfite pyrosequencing. MET, RAB3IP and CHRM3 protein expression was determined by western blotting and IHC. MET proto-oncogene transcription and 5-hydroxymethylcytosine (5-hmc) were evaluated by quantitative real-time-PCR. 

Results

 Global LINE-1 methylation levels in LM were significantly lower compared with the matched PC (PC=66.2% vs LM=63.8%; p<0.001). More importantly, we observed that specific LINE-1 sequences residing within the intronic regions of multiple proto-oncogenes, MET (p<0.001), RAB3IP (p=0.05) and CHRM3 (p=0.01), were significantly hypomethylated in LM tissues compared with corresponding matched PC. Furthermore, reduced methylation of specific LINE-1 elements within the MET gene inversely correlated with induction of MET expression in CRC metastases (R=−0.44; p<0.0001). Finally, increased 5-hmc content was associated with LINE-1 hypomethylation. 

Conclusions

 Our results provide novel evidence that hypomethylation of specific LINE-1 elements permits inadvertent activation of methylation-silenced MET, RAB3IP and CHRM3 proto-oncogenes in CRC metastasis. Moreover, since 5-hmc content inversely correlated with LINE-1 hypomethylation in neoplastic tissues, our results provide important mechanistic insights into the fundamental processes underlying global DNA hypomethylation in human CRC.

The prognosis of gastric cancer (GC) patients with peritoneal dissemination remains poor, and a better understanding of the underlying mechanisms is critical for the development of new treatments that will improve survival in these patients. This study aimed to clarify the clinical and biological role of two key metastasis-associated long non-coding RNAs (lncRNAs) in GC. We analyzed the expression levels of two lncRNAs-Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1 (MALAT1) and HOX-Antisense Intergenic RNA (HOTAIR)-by real-time reverse transcription PCR in 300 gastric tissues (150 GC and 150 adjacent normal mucosa), and in seven GC cell lines. Functional characterization for the role of HOTAIR in GC was performed by small interfering RNA (siRNA) knockdown, followed by series of in-vitro and in-vivo experiments. Expression of both lncRNAs was significantly higher in cancerous tissues than in corresponding normal mucosa, and higher expression of these lncRNAs significantly correlated with peritoneal metastasis in GC patients. In addition, elevated HOTAIR expression emerged both as an independent prognostic and risk factor for peritoneal dissemination. SiRNA knockdown of HOTAIR in GC cells significantly inhibited cell proliferation, migration and invasion, but concurrently enhanced the anoikis rate in transfected cells. In an in vivo assay, HOTAIR siRNA-transfected MKN45 cells injected into nude mice inhibited the growth of xenograft tumors and peritoneal metastasis compared with controls. Our data provide novel evidence for the biological and clinical significance of HOTAIR expression as a potential biomarker for identifying patients with peritoneal metastasis, and as a novel therapeutic target in patients with gastric neoplasia.

Exosomal noncoding RNAs (ncRNAs) have unique expression profiles reflecting the characteristics of a tumor, and their role in tumor progression and metastasis is emerging. However, the significance of circulating exosomal ncRNAs in the prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC) remains to be elucidated. We therefore determined the prognostic significance of circulating exosomal ncRNAs (miRNA-21 and lncRNA-ATB) for human HCC. This prospective study enrolled 79 HCC patients between October 2014 and September 2015. Exosomes were extracted from serum samples using the ExoQuick Exosome Precipitation Solution. To validate the isolation of the exosomes from serum, immunoblotting for exosome markers and characterization of nanoparticle using NanoSight were performed. NcRNAs were isolated from exosomes using the miRNeasy serum/plasma micro kit. Both circulating exosomal miRNA-21 and lncRNA-ATB were related to TNM stage and other prognostic factors, including the T stage and portal vein thrombosis. Multivariate analysis using the Cox regression test identified that both higher miRNA-21 and higher lncRNA-ATB were independent predictors of mortality and disease progression, along with larger tumor size and higher C-reactive protein (all p < 0.05). The overall survival and progression-free survival were significantly lower in patients with higher circulating levels of exosomal miRNA-21 (≥0.09) and lncRNA-ATB (≥0.0016) (log-rank test: p < 0.05). In conclusion, our study has provided strong evidence that circulating exosomal ncRNAs (miRNA-21 and lncRNA-ATB) are novel prognostic markers and therapeutic targets for HCC.

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived vesicles that mediate intercellular communications. Neutrophils produce different subtypes of EVs during inflammatory responses. Neutrophil-derived trails (NDTRs) are generated by neutrophils migrating toward inflammatory foci, whereas neutrophil-derived microvesicles (NDMVs) are thought to be generated by neutrophils that have arrived at the inflammatory foci. However, the physical and functional characteristics of neutrophil-derived EVs are incompletely understood. In this study, we investigated the similarities and differences between neutrophil-derived EV subtypes. Neutrophil-derived EVs shared similar characteristics regarding stimulators, generation mechanisms, and surface marker expression. Both neutrophil-derived EV subtypes exhibited similar functions, such as direct bactericidal activity and induction of monocyte chemotaxis via MCP-1. However, NDTR generation was dependent on the integrin signaling, while NDMV generation was dependent on the PI3K pathway. The CD16 expression level differentiated the neutrophil-derived EV subtypes. Interestingly, both subtypes showed different patterns of miRNA expression and were easily phagocytosed by monocytes. NDTRs induced M1 macrophage polarization, whereas NDMVs induced M2 macrophage polarization. Moreover, NDTRs but not NDMVs exerted protective effects against sepsis-induced lethality in a murine sepsis model and pathological changes in a murine chronic colitis model. These results suggest a new insight into neutrophil-derived EV subtypes: proinflammatory NDTRs and anti-inflammatory NDMVs.

Abstract Phospholipase C beta (PLCβ) exerts diverse biological processes, including inflammatory responses and neurogenesis; however, its role in bone cell function is largely unknown. Among the PLCβ isoforms (β1–β4), we found that PLCβ4 was most highly upregulated during osteoclastogenesis. In this study, we used global knockout and osteoclast lineage-specific PLCβ4 conditional knockout ( LysM-PLCβ4 −/− ) mice and demonstrated that PLCβ4 is a crucial regulator of receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. Deletion of PLCβ4, both globally and in the osteoclast lineage, resulted in a significant reduction in osteoclast formation and the downregulation of osteoclast marker genes. Importantly, LysM-PLCβ4 −/− male mice exhibited greater bone mass and a lower number of osteoclasts in vivo than their wild-type littermates, without altering osteoblast function. Mechanistically, we found that PLCβ4 forms a complex with p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) and MAPK kinase 3 (MKK3) in response to RANKL, thereby modulating p38 activation. An immunofluorescence assay further confirmed the colocalization of PLCβ4 with p38 after RANKL exposure. Moreover, p38 activation rescued the impaired osteoclast formation and restored the reduced p38 phosphorylation due to PLCβ4 deficiency. Thus, our findings reveal that PLCβ4 controls osteoclastogenesis via the RANKL-dependent MKK3-p38 MAPK pathway, and PLCβ4 may be a potential therapeutic candidate for bone diseases such as osteoporosis.