Abstract Basic knowledge on the biology and epidemiology of equine strongylid species remains insufficient although it would contribute to the design of better parasite control strategies. Nemabiome is a convenient tool to quantify and to identify species in bulk samples that could overcome the hurdle that cyathostomin morphological identification represents. To date, this approach has relied on the internal transcribed spacer 2 (ITS-2) of the ribosomal RNA cistron and its predictive performance and associated biases both remain unaddressed. This study aimed to bridge this knowledge gap using cyathostomin mock communities and comparing performances of the ITS-2 and a cytochrome c oxidase subunit I (COI) barcode newly developed in this study. The effects of bioinformatic parameters were investigated to determine the best analytical pipelines. Subsequently, barcode predictive abilities were compared across various mock community compositions. The replicability of the approach and the amplification biases of each barcode were estimated. Results were also compared between various types of biological samples, i.e. eggs, infective larvae or adults. Overall, the proposed COI barcode was suboptimal relative to the ITS-2 rDNA region, because of PCR amplification biases, a reduced sensitivity and higher divergence from the expected community composition. Metabarcoding yielded consistent community composition across the three sample types, although infective larvae may remain the most tractable in the field. Additional strategies to improve the COI barcode performances are discussed. These results underscore the critical need of mock communities for metabarcoding purposes.

Abstract In Sudan, resistance to benzimidazoles has been reported recently in cattle and goats from South Darfur. Herein, ivermectin efficacy against gastrointestinal nematodes (GINs) was evaluated in sheep and goats in three study areas in South Darfur. The faecal egg count reduction test (FECRT) was used to evaluate the efficacy of ivermectin in sheep and goats naturally infected with GINs in the region of Bulbul (goats: n =106), Kass (goats: n =40) and Nyala (Domaia (sheep: n =47, goats: n =77) and the University farm (goats: n =52)), using different treatment plans, and the efficacy was evaluated 12 days after treatment. Ivermectin efficacy was also evaluated in goats experimentally infected using local Haemonchus contortus isolates from Kass and Nyala. Nematodes surviving ivermectin treatment in goats in Bulbul and Nyala were harvested and larvae used to infect worm-free male sheep ( n =6, ≤6 months old). Infected sheep were dosed subcutaneously with ivermectin every eight days with increasing doses from 0.2 mg/kg to 1.6 mg/kg bodyweight (bw). Reduced ivermectin efficacy was identified in sheep and goats in the four study locations. Using a paired statistic, the efficacy of a therapeutic dose in sheep was 75.6% (90% upper credible limit (UCrL): 77.5%), while twice the recommended dose led to a reduction of 92.6% (90% UCrL: 93.3%). In goats, the FECRs of a therapeutic dose were 72.9 – 95.3% (90% UCrL range: 73.6 – 95.7%) in Bulbul, Nyala Domaia, Nyala University farm and Kass. Twice the dose recommended for goats in Bulbul revealed a 90% UCrL of 87.6%. All post-treatment faecal cultures contained only Haemonchus spp. larvae. The experimental infection trials in sheep and goats supported our findings from field trials and calculated upper 90% CrL of below 98.9%. For the first time highly ivermectin resistant H. contortus populations have been identified in sheep and goats in Sudan, and resistance was experimentally confirmed.

A bstract Cyathostomins are a complex of 50 intestinal parasite species infecting horses and wild equids. The massive administration of modern anthelmintic drugs has increased their relative abundance in horse helminth communities and selected drug-resistant isolates worldwide. Cylicocyclus nassatus is the most prevalent and the most abundant species. The tedious identification and isolation of these worms has hampered studies of their biology that remain largely uncharacterised. Here we have leveraged ultra-low input sequencing protocols to build a reference genome for the most prevalent horse strongyle species. Using this resource we have established the first estimates of its genetic diversity and population structure on a gradient ranging from Ukraine (close to modern horse domestication area) to North America, while capturing a XIX th century snapshot of C. nassatus diversity in Egypt. Our results support a diverse and lowly structured global population and a significant loss of genetic diversity in modern populations over the last century. We identified the first genetic candidates upon which pyrantel - an anthelmintic drug used in companion animals - selection likely applies in field populations, highlighting previously suspected genes coding for nicotinic acetylcholine receptor subunits, and identifying new candidates showing differential expression in independently evolved C. elegans lines. These results offer a first resource to widen current knowledge on cyathostomin biology, unravel novel aspects of pyrantel resistance mechanisms and provide candidate genes to track pyrantel resistance in the field.

Abstract Macrocyclic lactone (ML) resistance has emerged in many parasitic nematodes including the pathogenic horse roundworm Parascaris univalens . The underlying mechanism of ML resistance and the drug penetration routes into the nematodes remain to be elucidated. Drug efflux by P-glycoproteins is considered a potential resistance mechanism but conclusive functional evidence is lacking. To this end, we used a motility assay modified to stimulate pharyngeal pumping (PP) by bacteria or serotonin and tissue-specific expression of Pun- PGP-9 in the free-living model nematode Caenorhabditis elegans . Here, stimulation of PP was identified as an important factor for C. elegans ML susceptibility, increasing the EC 50 values of ivermectin by up to 11.1-fold and of moxidectin by 1.2-fold. In this context, intestinal Pun- PGP-9 expression elicited a protective effect against ivermectin and moxidectin only in the presence of PP stimulation, increasing the EC 50 values by approximately 3- to 4-fold (ivermectin) or by < 1.3-fold (moxidectin). Conversely, epidermal Pun- PGP-9 expression protected against moxidectin regardless of PP with EC 50 fold changes below 1.5 but against ivermectin with a considerable 2.9-fold EC 50 increase only when the drug is not actively ingested. Our results highlight the role of active drug ingestion by nematodes for susceptibility and provide conclusive functional evidence for a contribution of P-glycoproteins to ML resistance. Author Summary Parasitic nematode infections pose a serious threat to animal health, in particular in light of the widespread anthelmintic resistance in different nematode species. In equines, the roundworm Parascaris univalens is a major pathogen of foals, exhibiting widespread resistance against macrocyclic lactones (MLs). This represents a particular challenge to animal health, but the underlying mechanisms and drug penetration routes remain mostly unknown. P-glycoprotein ABC-transporters have been linked to ML resistance in several parasitic nematodes. Here we demonstrate by tissue-specific overexpression of Pun- PGP-9 in the free-living model nematode Caenorhabditis elegans their ability to reduce the susceptibility to two commonly used MLs, ivermectin and moxidectin. At the same time, active drug ingestion by pharyngeal pumping (PP) strongly enhanced ivermectin and moderately effects moxidectin susceptibility. In more detail, the effect of intestinal or epidermal Pun- PGP-9 was dependent on active drug ingestion. These observations indicate differences in the drug penetration routes between ML derivatives and allow novel insight into the functional role of P-glycoproteins.

Abstract Caenorhabditis elegans is an appealing tool for experimental evolution and for working with antiparasitic drugs, from understanding the molecular mechanisms of drug action and resistance to uncover new drug targets. We present a new methodology for studying the impact of antiparasitic drugs in C. elegans . Viscous medium was initially designed for C. elegans maintenance during long-term evolution experiments. Viscous medium provides a less structured environment than the standard nematode growth media agar, yet the bacteria food source remains suspended. Further, the Viscous medium offers the worm population enough support to move freely, mate, and reproduce at a rate comparable to standard agar cultures. Here, the Viscous medium was adapted for use in antiparasitic research. We observed a similar sensitivity of C. elegans to anthelmintic drugs as in standard liquid media and statistical difference to the standard agar media through a larval development assay. Using Viscous medium in C. elegans studies will considerably improve antiparasitic resistance research, and this medium could be used in studies aimed at understanding long-term multigenerational drug activity.

Anthelmintic resistance occurs worldwide in strongyles of ruminants but data from low-income countries are sparse and rarely apply most up to date methods, while effects of management practices in these countries are poorly documented. In Mozambique, benzimidazole resistance has been previously reported; the present study followed this up in detail, applying in vivo faecal egg count (FEC) reduction test (FECRT), in vitro egg hatch test (EHT) and molecular deep amplicon sequencing approaches targeting the internal transcribed spacer 2 (ITS-2, nemabiome) and the isotype 1 β-tubulin gene to determine the resistance status on farms and the strongyle species involved. Adult Landim goats (433) from six semi-intensive and ten extensive farms (22-30 animals/farm) from Maputo Province were visited April 2021 to February 2022. Fenbendazole (5 mg/kg bw, Panacur®) was administered orally and FEC determined using Mini-FLOTAC. The eggCounts package was used to calculate FECRs with 90% confidence intervals from paired day 0 and 14 data. In vivo and in vitro tests detected AR on 5/16 (31%) farms. This included 1/10 extensive and 4/6 semi-intensive farms. The odds of finding resistant strongyles on a semi-intensive commercial farm was 40-fold higher than on an extensive farm (p = 0.016, logistic regression). A strong, negative correlation was observed between FECRT and EHT EC

Abstract Anthelmintic resistance (AR) in cattle gastrointestinal nematodes (GIN) is an increasing global concern, with low to moderate levels recently documented in Central Europe. This study reports on resistance against both macrocyclic lactones (MLs) and benzimidazoles (BZs), highlighting that AR is spreading. The Fecal Egg Count Reduction Test (FECRT) remains the primary tool for AR assessment, yet differing methodologies and recent guideline updates complicate resistance interpretation across studies. Statistical methods, such as Bayesian approaches used by eggCounts and bayescount, yield varying confidence intervals, further influencing results. Notably, the nemabiome analysis identified Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora as predominant species in the region, though unexpected diversity among farms with additional GIN species occurring sometimes even at high frequency, suggests morphological analysis of coprocultures may underestimate species prevalence. Detecting AR against both drug classes on some farms underscores the urgency of implementing sustainable strategies, such as targeted selective treatment and combinations of anthelmintics with different mode of action, to prevent scenarios of multi-drug resistance observed elsewhere. Effective resistance management requires immediate discussions with veterinarians and stakeholders to steer toward informed, preventive measures in cattle farming.

Abstract Background Faecal egg counts (FECs) are essential for diagnosing helminth infections and guiding treatment decisions. For camels, no evaluations of coproscopic methods regarding precision, sensitivity and correlation between individual and pooled faecal samples are currently available. Methods Here, 410 camel faecal samples were collected in 2022 from South Darfur State, Sudan, and analysed to compare the semi-quantitative flotation, McMaster and Mini-FLOTAC methods in terms of precision, sensitivity, inter-rater reliability and helminth egg count correlations, as well as the effects of pooling samples. Six samples were used to assess precision for McMaster and Mini-FLOTAC, while the remaining 404 samples were evaluated for sensitivity, inter-rater reliability and egg count correlations. Of these, 80 samples were used in pooling experiments. Results Six analyses of each sample ( n = 6) using the McMaster and Mini-FLOTAC methods revealed no significant difference in the coefficient of variation between the two. For strongyle eggs, 48.8%, 52.7% and 68.6% were positive for McMaster, semi-quantitative flotation and Mini-FLOTAC, respectively. The sensitivity of the three methods showed only minimal improvement when three egg counts were performed on the same sample. McMaster and Mini-FLOTAC had similar sensitivity for Strongyloides spp. (3.5% frequency), while it was lower for semi-quantitative flotation at 2.5%. Mini-FLOTAC was more sensitive for Moniezia spp., detecting 7.7% of positives compared with 4.5% for semi-quantitative flotation and 2.2% for McMaster. For Trichuris spp., frequencies were 0.3% with Mini-FLOTAC, 0.7% with McMaster and 1.7% with semi-quantitative flotation. Mini-FLOTAC also detected higher strongyle eggs per gram (EPG) of faeces (mean 537.4) compared with McMaster (330.1). More samples exceeded treatment thresholds with Mini-FLOTAC, with 28.5% of animals having EPG ≥ 200 compared with 19.3% for McMaster, while 19.1% showed EPG ≥ 500 with Mini-FLOTAC compared with 12.1% with McMaster. There was no significant correlation between individual and pooled strongyle FECs, as indicated by Pearson correlation coefficients of r ≥ 0.368 ( P ≥ 0.113) and Spearman correlation. Conclusions Mini-FLOTAC outperformed semi-quantitative flotation and McMaster in diagnosing helminth infections in camels, offering greater sensitivity and detecting higher EPGs, particularly for strongyles, Strongyloides spp. and Moniezia spp. Thus, treatment decisions based on Mini-FLOTAC EPGs will lead to more treatments. Graphical Abstract

In Sudan, resistance to benzimidazoles has been reported recently in cattle and goats from South Darfur. Herein, ivermectin efficacy against gastrointestinal nematodes (GINs) was evaluated in sheep and goats in three study areas in South Darfur. The faecal egg count reduction test (FECRT) was used to evaluate the efficacy of ivermectin in sheep and goats naturally infected with GINs in the region of Bulbul (goats: n = 106), Kass (goats: n = 40) and Nyala (Domaia (sheep: n = 47, goats: n = 77) and the University farm (goats: n = 52)), using different treatment plans, and the efficacy was evaluated 12 days after treatment. Ivermectin efficacy was also evaluated in goats experimentally infected using local Haemonchus contortus isolates from Kass and Nyala. Nematodes surviving ivermectin treatment in goats in Bulbul and Nyala were harvested and larvae used to infect worm-free male sheep ( n = 6, ≤6 months old). Infected sheep were dosed subcutaneously with ivermectin every eight days with increasing doses from 0.2 mg/kg to 1.6 mg/kg bodyweight (bw). Reduced ivermectin efficacy was identified in sheep and goats in the four study locations. Using a paired statistic, the efficacy of a therapeutic dose in sheep was 75.6% (90% upper credible limit (UCrL): 77.5%), while twice the recommended dose led to a reduction of 92.6% (90% UCrL: 93.3%). In goats, the FECRs of a therapeutic dose were 72.9–95.3% (90% UCrL range: 73.6–95.7%) in Bulbul, Nyala Domaia, Nyala University farm and Kass. Twice the dose recommended for goats in Bulbul revealed a 90% UCrL of 87.6%. All post-treatment faecal cultures contained only Haemonchus spp. larvae. The experimental infection trials in sheep and goats supported our findings from field trials and calculated upper 90% CrL of below 98.9%. For the first time highly ivermectin resistant H . contortus populations have been identified in sheep and goats in Sudan, and resistance was experimentally confirmed.