SUMMARY Ductal carcinoma in situ (DCIS) is the most common precursor of invasive breast cancer (IBC), with variable propensity for progression. We have performed the first multiscale, integrated profiling of DCIS with clinical outcomes by analyzing 677 DCIS samples from 481 patients with 7.1 years median follow-up from the Translational Breast Cancer Research Consortium (TBCRC) 038 study and the Resource of Archival Breast Tissue (RAHBT) cohorts. We identified 812 genes associated with ipsilateral recurrence within 5 years from treatment and developed a classifier that was predictive of DCIS or IBC recurrence in both cohorts. Pathways associated with recurrence include proliferation, immune response, and metabolism. Distinct stromal expression patterns and immune cell compositions were identified. Our multiscale approach employed in situ methods to generate a spatially resolved atlas of breast precancers, where complementary modalities can be directly compared and correlated with conventional pathology findings, disease states, and clinical outcome. HIGHLIGHTS ⍰ Development of a new classifier for DCIS recurrence or progression ⍰ Outcome associated pathways identified across multiple data types and compartments ⍰ Four stroma-specific signatures identified ⍰ CNAs characterize DCIS subgroups associated with high risk invasive cancers

Importance Active monitoring for low-risk ductal carcinoma in situ (DCIS) of the breast has been proposed as an alternative to guideline-concordant care, but the safety of this approach is unknown. Objective To compare rates of invasive cancer in patients with low-risk DCIS receiving active monitoring vs guideline-concordant care. Design, Setting, and Participants Prospective, randomized noninferiority trial enrolling 995 women aged 40 years or older with a new diagnosis of hormone receptor–positive grade 1 or grade 2 DCIS without invasive cancer at 100 US Alliance Cancer Cooperative Group clinical trial sites from 2017 to 2023. Interventions Participants were randomized to receive active monitoring (follow-up every 6 months with breast imaging and physical examination; n = 484) or guideline-concordant care (surgery with or without radiation therapy; n = 473). Main Outcomes and Measures The primary outcome was 2-year cumulative risk of ipsilateral invasive cancer diagnosis, according to planned intention-to-treat and per-protocol analyses, with a noninferiority bound of 0.05%. Results The median age of the 957 participants analyzed was 63.6 (95% CI, 55.5-70.5) years in the guideline-concordant care group and 63.7 (95% CI, 60.0-71.6) years in the active monitoring group. Overall, 15.7% of participants were Black and 75.0% were White. In this prespecified primary analysis, median follow-up was 36.9 months; 346 patients had surgery for DCIS, 264 in the guideline-concordant care group and 82 in the active monitoring group. Forty-six women were diagnosed with invasive cancer, 19 in the active monitoring group and 27 in the guideline-concordant care group. The 2-year Kaplan-Meier cumulative rate of ipsilateral invasive cancer was 4.2% in the active monitoring group vs 5.9% in the guideline-concordant care group, a difference of −1.7% (upper limit of the 95% CI, 0.95%), indicating that active monitoring is not inferior to guideline-concordant care. Invasive tumor characteristics did not differ significantly between groups. Conclusions and Relevance Women with low-risk DCIS randomized to active monitoring did not have a higher rate of invasive cancer in the same breast at 2 years compared with those randomized to guideline-concordant care. Trial Registration ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02926911

Macrophages are pivotal in driving breast tumor development, progression, and resistance to treatment, particularly in estrogen receptor-positive (ER+) tumors, where they infiltrate the tumor microenvironment (TME) influenced by cancer cell-secreted factors. By analyzing single-cell RNA-sequencing data from 25 ER+ tumors, we elucidated interactions between cancer cells and macrophages, correlating macrophage density with epithelial cancer cell density. We identified that S100A11, a previously unexplored factor in macrophage-cancer crosstalk, predicts high macrophage density and poor outcomes in ER+ tumors. We found that recombinant S100A11 enhances macrophage infiltration and migration in a dose-dependent manner. Additionally, in 3D models, we showed that S100A11 expression levels in ER+ cancer cells predict macrophage infiltration patterns. Neutralizing S100A11 decreased macrophage recruitment, both in cancer cell lines and in a clinically relevant patient-derived organoid model, underscoring its role as a paracrine regulator of cancer-macrophage interactions in the protumorigenic TME. This study offers novel insights into the interplay between macrophages and cancer cells in ER+ breast tumors, highlighting S100A11 as a potential therapeutic target to modulate the macrophage-rich tumor microenvironment.

Abstract No Special Type breast cancer (NST; commonly known as Invasive Ductal Carcinoma (IDC)) and Invasive Lobular Carcinoma (ILC) are the two major histological subtypes of breast cancer with significant differences in clinicopathological and molecular characteristics. The defining pathognomonic feature of ILC is loss of cellular adhesion protein, E-cadherin ( CDH1 ). We have previously shown that E-cadherin functions as a negative regulator of the Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF1R) and propose that E-cadherin loss in ILC sensitizes cells to growth factor signaling which thus alters their sensitivity to growth factor signaling inhibitors and their downstream activators. To investigate this potential therapeutic vulnerability, we generated CRISPR-mediated CDH1 knockout ( CDH1 KO) IDC cell lines (MCF7, T47D, ZR75.1) to uncover the mechanism by which loss of E-cadherin results in IGF pathway activation. CDH1 KO cells demonstrated enhanced invasion and migration that was further elevated in response to IGF1, serum and Collagen I. CDH1 KO cells exhibited increased sensitivity to IGF resulting in elevated downstream signaling. Despite minimal differences in membranous IGF1R levels between wildtype (WT) and CDH1 KO cells, significantly higher ligand-receptor interaction was observed in the CDH1 KO cells, potentially conferring enhanced downstream signaling activation. Critically, increased sensitivity to IGF1R, PI3K, Akt and MEK inhibitors was observed in CDH1 KO cells and ILC patient-derived organoids, suggesting that these targets require further exploration in ILC treatment and that CDH1 loss may be exploited as a biomarker of response for patient stratification.

Abstract [N=135] Mixed invasive ductal and lobular carcinoma (mDLC) is a rare histologic subtype of breast cancer displaying both E-cadherin positive ductal and E-cadherin negative lobular morphologies within the same tumor, posing challenges with regard to anticipated clinical management. It remains unclear whether these distinct morphologies also have distinct biology and risk of recurrence. Our spatially-resolved transcriptomic, genomic, and single-cell profiling revealed clinically significant differences between ductal and lobular tumor regions including distinct intrinsic subtype heterogeneity (e.g., mDLC with TNBC/basal ductal and ER+/luminal lobular regions), distinct enrichment of senescence/dormancy and oncogenic (ER and MYC) signatures, genetic and epigenetic CDH1 inactivation in lobular, but not ductal regions, and 4) single-cell ductal and lobular sub-populations with unique oncogenic signatures further highlighting intra-regional heterogeneity. Altogether, we demonstrated that the intra-tumoral morphological/histological heterogeneity within mDLC is underpinned by intrinsic subtype and oncogenic heterogeneity which may result in prognostic uncertainty and therapeutic dilemma. Significance [N=58] mDLC displays both ductal and lobular tumor regions. Our multi-omic profiling approach revealed that these morphologically distinct tumor regions harbor distinct intrinsic subtypes and oncogenic features that may cause prognostic uncertainty and therapeutic dilemma. Thus histopathological/molecular profiling of individual tumor regions may guide clinical decision making and benefit patients with mDLC, particularly in the advanced setting where there is increased reliance on next generation sequencing. Graphical Abstract

Abstract Breast cancer is categorized by the molecular and histologic presentation of the tumor, with the major histologic subtypes being No Special Type (NST) and Invasive Lobular Carcinoma (ILC). ILC are characterized by growth in a single file discohesive manner with stromal infiltration attributed to their hallmark pathognomonic loss of E-cadherin ( CDH1 ). Few ILC cell line models are available to researchers. Here we report the successful establishment and characterization of a novel ILC cell line, WCRC-25, from a metastatic pleural effusion from a postmenopausal Caucasian woman with metastatic ILC. WCRC-25 is an ER-negative luminal epithelial ILC cell line with both luminal and Her2-like features. It exhibits anchorage independent growth and haptotactic migration towards Collagen I. Sequencing revealed a CDH1 Q706* truncating mutation, together with mutations in FOXA1, CTCF, BRCA2 and TP53 , which were also seen in a series of metastatic lesions from the patient. Copy number analyses revealed amplification and deletion of genes frequently altered in ILC while optical genome mapping revealed novel structural rearrangements. RNA-seq analysis comparing the primary tumor, metastases and the cell line revealed signatures for cell cycle progression and receptor tyrosine kinase signaling. To assess targetability, we treated WCRC-25 with AZD5363 and Alpelisib confirming WCRC-25 as susceptible to PI3K/AKT signaling inhibition as predicted by our RNA sequencing analysis. In conclusion, we report WCRC-25 as a novel ILC cell line with promise as a valuable research tool to advance our understanding of ILC and its therapeutic vulnerabilities. Financial support The work was in part supported by a Susan G Komen Leadership Grant to SO (SAC160073) and NCI R01 CA252378 (SO/AVL). AVL and SO are Komen Scholars, Hillman Foundation Fellows and supported by BCRF. This project used the UPMC Hillman Cancer Center and Tissue and Research Pathology/Pitt Biospecimen Core shared resource which is supported in part by award P30CA047904. This research was also supported in part by the University of Pittsburgh Center for Research Computing, RRID:SCR_022735, through the resources provided. Specifically, this work used the HTC cluster, which is supported by NIH award number S10OD028483. Finally, partial support was provided by the Magee-Womens Research Institute and Foundation, The Shear Family Foundation, and The Metastatic Breast Cancer Network.

1109 Background: Invasive lobular breast cancer (ILC) is the most common special type of breast cancer and has unique clinicopathological and molecular hallmarks that differentiate it from the more common invasive carcinoma – no special type (NST). Despite these differences, ILC and NST are treated as a single entity and there is a lack of ILC-targeted therapies. To fill this gap, we sought to identify novel molecular alterations in ILC that could be exploited for targeted therapies. Methods: Differential gene expression and Geneset Enrichment and Variation analyses were performed on RNA-seq data from three large public breast cancer databases – the Sweden Cancerome Analysis Network-Breast (SCAN-B; luminal A ILC N=263, luminal A NST N=1162), The Cancer Genome Atlas (TCGA; luminal A ILC N=157, luminal A NST N=307) and Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium (METABRIC; luminal A ILC N=65, luminal A NST N=533). Pathways enriched in overlapping differentially expressed genes from these datasets were clustered using Jaccard similarity to identify pathways enriched in ILC. The cAMP/PKA/CREB signaling was studied in ILC, ILC-like and NST cell lines and patient-derived organoids (PDOs) using forskolin, an activator of the pathway. Results: Clinicopathological features of patients with ILC and NST in SCAN-B were similar to prior population-based studies. There was a consistent pattern of up-regulation of cAMP/PKA/CREB related signaling in ILC compared to NST in SCAN-B, TCGA and METABRIC. Treatment with forskolin resulted in a greater increase in phospho-CREB in ILC cell lines and organoids than NST. CRISPR deletion of CDH1 in NST cell lines did not alter response of cells to forskolin as measured by phospho-CREB. Forskolin treatment caused growth inhibition in ILC and NST, with ILC cell lines being more sensitive to forskolin-mediated growth inhibition. Conclusions: In three separate datasets, cAMP/PKA/CREB signaling was identified to be higher in ILC than NST. This in silico finding was validated in cell line and organoid models. Loss of CDH1 was not sufficient to mediate this phenotype. Future studies should investigate the mechanisms for differential cAMP/PKA/CREB signaling and the potential for therapeutic targeting in patients with ILC.

Macrophages are pivotal in driving breast tumor development, progression, and resistance to treatment, particularly in estrogen receptor-positive (ER+) tumors, where they infiltrate the tumor microenvironment (TME) influenced by cancer cell-secreted factors. By analyzing single-cell RNA sequencing data from 25 ER+ tumors, we elucidated interactions between cancer cells and macrophages, correlating macrophage density with epithelial cancer cell density. We identified that S100A11, a previously unexplored factor in macrophage-cancer crosstalk, predicts high macrophage density and poor outcomes in ER+ tumors. We found that recombinant S100A11 enhances macrophage infiltration and migration in a dose-dependent manner. Additionally, in a 3D matrix using a panel of three ER+ breast cancer cell lines, we showed that secreted S100A11 levels from cancer cells were associated with increased monocyte infiltration that subsequently differentiation toward macrophages. Genetic silencing of S100A11 in the S100A11-high T47D cancer cells reduced monocyte infiltration, consistent with results using a S100A11 blocking antibody in T47D cancer cells and in a clinically relevant patient-derived organoid model. Phenotypic analysis of macrophages cocultured with T47D cancer cells following S100A11 knockdown revealed lower expression of the immunosuppressive marker CD206, further underscoring the role of S100A11 as a paracrine regulator of pro-tumorigenic cancer-macrophage crosstalk. This study offers novel insights into the interplay between macrophages and cancer cells in ER+ breast tumors, highlighting S100A11 as a potential therapeutic target to modulate the macrophage-rich tumor microenvironment.

Chemoresistance is a major driver of cancer deaths. One understudied mechanism of chemoresistance is quiescence. We used single cell culture to identify, retrieve, and RNA-Seq profile primary quiescent ovarian cancer cells (qOvCa). We found that many qOvCa differentially expressed genes are transcriptional targets of the Myocardin Related Transcription Factor/Serum Response Factor (MRTF/SRF) pathway. We also found that genetic disruption of MRTF-SRF interaction, or an MRTF/SRF inhibitor (CCG257081) impact qOvCa gene expression and induce a quiescent state in cancer cells. Suggesting a broad role for this pathway in quiescence, CCG257081 treatment induced quiescence in breast, lung, colon, pancreatic and ovarian cancer cells. Furthermore, CCG081 (i) maintained a quiescent state in patient derived breast cancer organoids and, (ii) induced tumor growth arrest in ovarian cancer xenografts. Together, these data suggest that MRTF/SRF pathway is a critical regulator of quiescence in cancer and a possible therapeutic target.