Abstract Clarification of the cytotoxic function of T cells is crucial for understanding human immune responses and immunotherapy procedures. Here, we report an event-triggered Bessel oblique plane microscopy (EBOPM) platform capable of smart 3D live imaging and phenotyping of chimeric antigen receptor (CAR)-modified T-cell cytotoxicity in cancer immunotherapy; the EBOPM platform has the following characteristics: an isotropic subcellular resolution of 320 nm, large-scale scouting over 400 interacting cell pairs, long-term observation across 5 hours, and quantitative analysis of the Terabyte-scale 3D, multichannel, time-lapse image datasets. Using this advanced microscopy platform, several key subcellular events in CAR-T cells were captured and comprehensively analyzed; these events included the instantaneous formation of immune synapses and the sustained changes in the microtubing morphology. Furthermore, we identified the actin retrograde flow speed, the actin depletion coefficient, the microtubule polarization and the contact area of the CAR-T/target cell conjugates as essential parameters strongly correlated with CAR-T-cell cytotoxic function. Our approach will be useful for establishing criteria for quantifying T-cell function in individual patients for all T-cell-based immunotherapies.

Abstract Although three-dimensional (3D) fluorescence microscopy is an essential tool for life science research, the fundamentally-limited optical throughput, as reflected in the compromise between speed and resolution, so far prevents further movement towards faster, clearer, and higher-throughput applications. We herein report a dual-stage mutual-feedback deep-learning approach that allows gradual reversion of microscopy degradation from high-resolution targets to low-resolution images. Using a single blurred-and-pixelated 3D image as input, our trained network infers a 3D output with notably higher resolution and improved contrast. The performance is better than conventional 1-stage network approaches. It pushes the throughput limit of current 3D fluorescence microscopy in three ways: notably reducing the acquisition time for accurate mapping of large organs, breaking the diffraction limit for imaging subcellular events with faster lower-toxicity measurement, and improving temporal resolution for capturing instantaneous biological processes. Combining our network approach with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate the imaging of vessels and neurons in the mouse brain at single-cell resolution and with a throughput of 6 minutes for a whole brain. We also image cell organelles beyond the diffraction limit at a 2-Hz volume rate, and map neuronal activities of freely-moving C. elegans at single-cell resolution and 30-Hz volume rate.

Abstract Though three-dimensional (3D) fluorescence microscopy has been an essential tool for modern life science research, the light scattering by biological specimens fundamentally prevents its more widespread applications in live imaging. We hereby report a deep-learning approach, termed ScatNet, that enables reversion of 3D fluorescence microscopy from high-resolution targets to low-quality, light-scattered measurements, thereby allowing restoration for a single blurred and light-scattered 3D image of deep tissue, with achieving improved resolution and signal-to-noise ratio. Our approach can computationally extend the imaging depth for current 3D fluorescence microscopes, without the addition of complicated optics. Combining ScatNet approach with cutting-edge light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate that the image restoration of cell nuclei in the deep layer of live Drosophila melanogaster embryos at single-cell resolution. Applying our approach to two-photon excitation microscopy, we could improve the signal and resolution of neurons in mouse brain beyond the photon ballistic region.

Abstract Long-term visualization of the dynamic organelle-organelle or protein-organelle interactions throughout the three-dimensional space of whole live cells is essential to better understand their functions, but this task remains challenging due to the limitations of existing three-dimensional fluorescence microscopy techniques, such as an insufficient axial resolution, low volumetric imaging rate, and photobleaching. Here, we present the combination of a progressive deep-learning superresolution strategy with a dual-ring-modulated SPIM design capable of visualizing the dynamics of intracellular organelles in live cells for hours at an isotropic spatial resolution of ∼100 nm in three dimensions and a temporal resolution up to ∼17 Hz. With a compelling spatiotemporal resolution, we substantially reveal the complex spatial relationships and interactions between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria throughout live cells, providing new insights into ER-mediated mitochondrial division. We also localized the motion of Drp1 oligomers in three dimensions and observed Drp1-mediated mitochondrial branching for the first time.