Eukaryotic neurotransmitter:sodium symporters (NSSs), targets for antidepressants and psychostimulants, terminate neurotransmission by sodium-driven reuptake. The crystal structure of LeuT(Aa), a prokaryotic NSS homolog, revealed an occluded state in which one leucine and two Na(+) ions are bound, but provided limited clues to the molecular mechanism of transport. Using steered molecular dynamics simulations, we explored the substrate translocation pathway of LeuT. We identified a second substrate binding site located in the extracellular vestibule comprised of residues shown recently to participate in binding tricyclic antidepressants. Binding and flux experiments showed that the two binding sites can be occupied simultaneously. The substrate in the secondary site allosterically triggers intracellular release of Na(+) and substrate from the primary site, thereby functioning as a "symport effector." Because tricyclic antidepressants bind differently to this secondary site, they do not promote substrate release from the primary site and thus act as symport uncouplers and inhibit transport.

Cocaine is a widely abused substance with psychostimulant effects that are attributed to inhibition of the dopamine transporter (DAT). We present molecular models for DAT binding of cocaine and cocaine analogs constructed from the high-resolution structure of the bacterial transporter homolog LeuT. Our models suggest that the binding site for cocaine and cocaine analogs is deeply buried between transmembrane segments 1, 3, 6 and 8, and overlaps with the binding sites for the substrates dopamine and amphetamine, as well as for benztropine-like DAT inhibitors. We validated our models by detailed mutagenesis and by trapping the radiolabeled cocaine analog [3H]CFT in the transporter, either by cross-linking engineered cysteines or with an engineered Zn2+-binding site that was situated extracellularly to the predicted common binding pocket. Our data demonstrate the molecular basis for the competitive inhibition of dopamine transport by cocaine.

A major obstacle to understanding the functional importance of dimerization between class A G protein–coupled receptors (GPCRs) has been the methodological limitation in achieving control of the identity of the components comprising the signaling unit. We have developed a functional complementation assay that enables such control, and we demonstrate it here for the human dopamine D2 receptor. The minimal signaling unit, two receptors and a single G protein, is maximally activated by agonist binding to a single protomer, which suggests an asymmetrical activated dimer. Inverse agonist binding to the second protomer enhances signaling, whereas agonist binding to the second protomer blunts signaling. Ligand-independent constitutive activation of the second protomer also inhibits signaling. Thus, GPCR dimer function can be modulated by the activity state of the second protomer, which for a heterodimer may be altered in pathological states. Our new methodology also makes possible the characterization of signaling from a defined heterodimer unit.

Neurotransmitters are removed from the synapse by neurotransmitter/Na+ symporters (NSSs) in a reuptake process driven by the Na+ gradient. Zhao et al. examined the coupling of substrate binding to structural transitions in the prokaryotic NSS homologue LeuT. Using single-molecule fluorescence resonance energy transfer, functional experiments and computational studies, they find that LeuT facilitates intracellular gate opening and substrate release at the intracellular face of the protein. Neurotransmitter/Na+ symporters (NSSs) terminate neuronal signalling by recapturing neurotransmitter released into the synapse in a co-transport (symport) mechanism driven by the Na+ electrochemical gradient1,2,3,4,5,6. NSSs for dopamine, noradrenaline and serotonin are targeted by the psychostimulants cocaine and amphetamine1, as well as by antidepressants7. The crystal structure of LeuT, a prokaryotic NSS homologue, revealed an occluded conformation in which a leucine (Leu) and two Na+ are bound deep within the protein8. This structure has been the basis for extensive structural and computational exploration of the functional mechanisms of proteins with a LeuT-like fold9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Subsequently, an ‘outward-open’ conformation was determined in the presence of the inhibitor tryptophan23, and the Na+-dependent formation of a dynamic outward-facing intermediate was identified using electron paramagnetic resonance spectroscopy24. In addition, single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging has been used to reveal reversible transitions to an inward-open LeuT conformation, which involve the movement of transmembrane helix TM1a away from the transmembrane helical bundle22. We investigated how substrate binding is coupled to structural transitions in LeuT during Na+-coupled transport. Here we report a process whereby substrate binding from the extracellular side of LeuT facilitates intracellular gate opening and substrate release at the intracellular face of the protein. In the presence of alanine, a substrate that is transported ∼10-fold faster than leucine15,25, we observed alanine-induced dynamics in the intracellular gate region of LeuT that directly correlate with transport efficiency. Collectively, our data reveal functionally relevant and previously hidden aspects of the NSS transport mechanism that emphasize the functional importance of a second substrate (S2) binding site within the extracellular vestibule15,20. Substrate binding in this S2 site appears to act cooperatively with the primary substrate (S1) binding site to control intracellular gating more than 30 Å away, in a manner that allows the Na+ gradient to power the transport mechanism.

While vaccines are vital for preventing COVID-19 infections, it is critical to develop new therapies to treat patients who become infected. Pharmacological targeting of a host factor required for viral replication can suppress viral spread with a low probability of viral mutation leading to resistance. In particular, host kinases are highly druggable targets and a number of conserved coronavirus proteins, notably the nucleoprotein (N), require phosphorylation for full functionality. In order to understand how targeting kinases could be used to compromise viral replication, we used a combination of phosphoproteomics and bioinformatics as well as genetic and pharmacological kinase inhibition to define the enzymes important for SARS-CoV-2 N protein phosphorylation and viral replication. From these data, we propose a model whereby SRPK1/2 initiates phosphorylation of the N protein, which primes for further phosphorylation by GSK-3a/b and CK1 to achieve extensive phosphorylation of the N protein SR-rich domain. Importantly, we were able to leverage our data to identify an FDA-approved kinase inhibitor, Alectinib, that suppresses N phosphorylation by SRPK1/2 and limits SARS-CoV-2 replication. Together, these data suggest that repurposing or developing novel host-kinase directed therapies may be an efficacious strategy to prevent or treat COVID-19 and other coronavirus-mediated diseases.

ABSTRACT Computational modeling and simulation of biomolecular systems at their functional pH ranges requires an accurate approach to exploring the pH dependence of conformations and interactions. Here we present a new approach – the Equilibrium Constant pH (ECpH) method – to perform conformational sampling of protein systems in the framework of molecular dynamics simulations in an N, P, T -thermodynamic ensemble. The performance of ECpH is illustrated for two proteins with experimentally determined conformational responses to pH change: the small globular water-soluble bovine b-lactoglobulin (BBL), and the dimer transmembrane antiporter CLC-ec1 Cl−/H+. We show that with computational speeds comparable to equivalent canonical MD simulations we performed, the ECpH trajectories reproduce accurately the pH-dependent conformational changes observed experimentally in these two protein systems, some of which were not seen in the corresponding canonical MD simulations. Abstract Figure Table of Contents artwork

Cell penetration after recognition of the SARS-CoV-2 virus by the ACE2 receptor, and the fusion of its viral envelope membrane with cellular membranes, are the early steps of infectivity. A region of the Spike protein (S) of the virus, identified as the "fusion peptide" (FP), is liberated at its N-terminal site by a specific cleavage occurring in concert with the interaction of the receptor binding domain of the Spike. Studies have shown that penetration is enhanced by the required binding of Ca 2+ ions to the FPs of corona viruses, but the mechanisms of membrane insertion and destabilization remain unclear. We have predicted the preferred positions of Ca 2+ binding to the SARS-CoV-2-FP, the role of Ca 2+ ions in mediating peptide-membrane interactions, the preferred mode of insertion of the Ca 2+ -bound SARS-CoV-2-FP and consequent effects on the lipid bilayer from extensive atomistic molecular dynamics (MD) simulations and trajectory analyses. In a systematic sampling of the interactions of the Ca 2+ -bound peptide models with lipid membranes SARS-CoV-2-FP penetrated the bilayer and disrupted its organization only in two modes involving different structural domains. In one, the hydrophobic residues F833/I834 from the middle region of the peptide are inserted. In the other, more prevalent mode, the penetration involves residues L822/F823 from the LLF motif which is conserved in CoV-2-like viruses, and is achieved by the binding of Ca 2+ ions to the D830/D839 and E819/D820 residue pairs. FP penetration is shown to modify the molecular organization in specific areas of the bilayer, and the extent of membrane binding of the SARS-CoV-2 FP is significantly reduced in the absence of Ca 2+ ions. These findings provide novel mechanistic insights regarding the role of Ca 2+ in mediating SARS-CoV-2 fusion and provide a detailed structural platform to aid the ongoing efforts in rational design of compounds to inhibit SARS-CoV-2 cell entry.SARS-CoV-2, the cause of the COVID-19 pandemic, penetrates host cell membranes and uses viral-to-cellular membrane fusion to release its genetic material for replication. Experiments had identified a region termed "fusion peptide" (FP) in the Spike proteins of coronaviruses, as the spearhead in these initial processes, and suggested that Ca 2+ is needed to support both functions. Absent structure and dynamics-based mechanistic information these FP functions could not be targeted for therapeutic interventions. We describe the development and determination of the missing information from analysis of extensive MD simulation trajectories, and propose specific Ca 2+ -dependent mechanisms of SARS-CoV-2-FP membrane insertion and destabilization. These results offer a structure-specific platform to aid the ongoing efforts to use this target for the discovery and/or of inhibitors.