ABSTRACT Previous virulence screens have indicated potential roles during Streptococcus pneumoniae infection for the one-carbon metabolism pathway component Fhs and proline synthesis mediated by ProABC. To define how these metabolic pathways affect S. pneumoniae virulence we have investigated phenotypes and transcription profiles of Δ fhs and Δ proABC strain mutants. S. pneumoniae capsular serotype 6B BHN418 Δ fhs and Δ proABC mutant strains were markedly reduced virulence in mouse models of systemic infection and pneumonia, but were still able to colonise the nasopharynx. Although the Δ fhs and Δ proABC mutant strains grew normally in complete media, both mutant strains had markedly impaired growth in chemically defined medium, human serum and human CSF. The Δ proABC strain also had impaired growth under conditions of osmotic and oxidative stress. When transferred to the serotype 2 D39 S. pneumoniae strain background, the Δ fhs mutation replicated the virulence and growth in serum phenotype of the BHN418 mutation. In contrast, the D39 Δ proABC mutant could cause septicaemia and grow in human serum, indicating the role of this genetic locus during virulence is strain-specific. In human sera the Δ fhs and Δ proABC mutants both had major derangements in global gene transcription affecting multiple but different metabolic pathways, identifying the corresponding S. pneumoniae metabolic functions affected by these genes under infection-related conditions. Our data demonstrate an essential role for the S. pneumoniae one- carbon metabolism and a strain-conditional role for proline biosynthesis for growth in physiological fluids and therefore systemic infection, and further demonstrate the vital importance of bacterial metabolism for disease pathogenesis. Importance Rapid adaptation to grow within the physiological conditions found in the host environment is an essential but poorly understood virulence requirement for systemic pathogens such as Streptococcus pneumoniae . We have now demonstrated an essential role for the one-carbon metabolism pathway and a conditional role depending on strain background for proline biosynthesis for S. pneumoniae growth in serum or CSF and therefore for systemic virulence. RNAseq data demonstrated that loss of one carbon metabolism or proline biosynthesis both have profound but differing effects on S. pneumoniae metabolism in human serum, identifying the metabolic processes dependent on each pathway during systemic infection. These data provide a more detailed understanding of the adaptations required by systemic bacterial pathogens in order to cause infection, and demonstrate that the requirement for some of these adaptations vary between strains from the same species and could therefore underpin strain variations in virulence potential.

To better understand Streptococcus pneumoniae pathogenesis we performed RNA sequencing on cerebrospinal fluid (CSF) from meningitis patients to identify bacterial genes expressed during invasion of the central nervous system. Comparison to transcriptome data for serotype 1 S. pneumoniae cultured in ex vivo human CSF defined a subset of 57 genes with high expression during human meningitis. Deletion of two of the most highly expressed genetic loci, bgaA (encodes for a beta-galactosidase) or the SP_1801-5 putative stress response operon, resulted in S. pneumoniae strains still able to transmigrate the blood brain barrier but which were more susceptible to complement opsonisation and unable to maintain brain infection in a murine meningitis model. In 1144 meningitis patients, infection with bgaA containing S. pneumoniae strains was associated with a higher mortality (22% versus 14% p=0.02). These data demonstrate that direct bacterial RNAseq from CSF can identify previously undescribed S. pneumoniae virulence factors required for meningitis pathogenesis.

Background In November 2011, Malawi introduced the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13) into the routine infant schedule. Four to seven years after introduction (2015-2018), rolling prospective nasopharyngeal carriage surveys were performed in the city of Blantyre. Carriage of Streptococcus pneumoniae vaccine serotypes (VT) remained higher than reported in developed countries, and VT impact was surprisingly asymmetric across age-groups. A dynamic transmission model was fit to survey data using a Bayesian Markov-chain Monte Carlo approach, to obtain insights into the determinants of post-PCV13 age-specific VT carriage.Results Accumulation of naturally acquired immunity with age and age-specific transmission potential were both key to reproducing the observed data. VT carriage reduction peaked sequentially over time, earlier in younger and later in older age-groups. Estimated vaccine efficacy (protection against carriage) was 66.87% (95% CI 50.49-82.26%), similar to previous estimates. Ten-year projected vaccine impact (VT carriage reduction) among 0-9 years old was lower than observed in other settings, at 76.23% (CI 95% 68.02-81.96%), with sensitivity analyses demonstrating this to be mainly driven by a high local force of infection.Conclusions We have identified both vaccine-related and host-related determinants of post-PCV13 pneumococcal VT transmission in Blantyre with vaccine impact determined by age-related characteristics of the local force of infection. These findings are likely to be generalisable to other Sub-Saharan African countries in which PCV impact has been lower than desired, and have implications for the interpretation of post-PCV carriage studies and future vaccination programs.* VT : vaccine type NVT : non-vaccine type PCV : pneumococcal conjugate vaccine CI : confidence interval bMCMC : Bayesian Markov chain Monte Carlo ODE : ordinary-differential equations FOI : force of infection dVP : duration of vaccine-induced protection

ABSTRACT The influence of Streptococcus pneumoniae metabolism on nasal epithelial interactions is under-explored. We have assessed S. pneumoniae mutations affecting glutamate 5 kinase ( proABC ) and formate tetrahydrofolate reductase ( fhs ). A Pia iron transporter ( piaA ) mutation was added to ensure attenuation in Experimental Human Pneumococcal Challenge (EHPC). Epithelial microinvasion by Δ proABC/piaA and Δ fhs/piaA strains was enhanced compared to wild-type (WT) in EHPC and Detroit 562 cell infection. In primary epithelium, acetylated tubulin and β catenin expression was increased following Δ proABC exposure and uteroglobin expression was increased with Δ fhs exposure. In Detroit 562 cells, WT and Δ proABC infection induced an inflammatory epithelial transcriptomic response. The Δ fhs/piaA strain induced primarily cellular stress/ repair gene responses. Differential caspase 3/7/8 activity appeared linked to pneumococcal pneumolysin activity and hydrogen peroxide secretion. Our findings highlight the broad-ranging effects of single gene mutations in pneumococcal metabolism which underlies the complexity of the differences between seemingly closely related pneumococci. GRAPHICAL ABSTRACT Bacterial transcriptomics revealed profound effects of biosynthesis gene mutations on bacterial gene expression under serum stress, with upregulation of bacterial virulence factors such as pneumolysin and hydrogen peroxide regulator genes (e.g. spxB) . Epithelial microinvasion by the isogenic mutants was increased compared to wild type strain, but bacterial load was not sufficient to account for the differences observed in epithelial gene expression. Deletion of the fhs gene induced a more intrinsic cellular stress and repair response, compared to the wild-type strain or deletion of the proABC operons which induced a more typical pro-inflammatory response. Differential effects were also seen in cellular re-modelling and caspase activity. We postulate that this link between bacterial metabolism and virulence under conditions of stress will ultimately influence the outcome of colonisation in terms of transmission potential, transition to disease and generation of protective immunity.

Abstract Invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) disease is a serious bloodstream infection that targets immune-compromised individuals, and causes significant mortality in sub-Saharan Africa. Salmonella enterica serovar Typhimurium ST313 causes the majority of iNTS in Malawi, and we performed an intensive comparative genomic analysis of 608 isolates obtained from fever surveillance at the Queen Elizabeth Hospital, Blantyre between 1996 and 2018. We discovered that following the upsurge of the well-characterised S. Typhimurium ST313 lineage 2 from 1999 onwards, two new multidrug-resistant sublineages designated 2.2 and 2.3, emerged in Malawi in 2006 and 2008, respectively. The majority of S. Typhimurium isolates from human bloodstream infections in Malawi now belong to sublineage 2.2 or 2.3. To identify factors that characterised the emergence of the prevalent ST313 sublineage 2.2, we performed genomic and functional analysis of two representative strains, D23580 (lineage 2) and D37712 (sublineage 2.2). Comparative genomic analysis showed that the chromosome of ST313 lineage 2 and sublineage 2.2 were broadly similar, only differing by 29 SNPs and small indels and a 3kb deletion in the Gifsy-2 prophage region that spanned the sseI pseudogene. Lineage 2 and sublineage 2.2 have unique plasmid profiles that were verified by long read sequencing. The transcriptome was initially explored in 15 infection-relevant conditions and within macrophages. Differential gene expression was subsequently investigated in depth in the four most important in vitro growth conditions. We identified up-regulation of SPI2 genes in non-inducing conditions, and down-regulation of flagellar genes in D37712, compared to D23580. Following phenotypic confirmation of transcriptional differences, we discovered that sublineage 2.2 had increased fitness compared with lineage 2 during mixed-growth in minimal media. We speculate that this competitive advantage is contributing to the continuing presence of sublineage 2.2 in Malawi.

Streptococcus pneumoniae, a common coloniser of the upper respiratory tract, invades nasopharyngeal epithelial cells without causing disease in healthy people. We hypothesised that surface expression of pneumococcal lipoproteins, recognised by the innate immune receptor TLR2, mediate epithelial microinvasion. Mutation of lgt in serotype 4 (TIGR4) and serotype 6B (BHN418) pneumococcal strains abolishes the ability of the mutants to activate TLR2 signalling. Loss of lgt also led to concomitant decrease in interferon signalling triggered by the bacterium. However, only BHN418 lgt::cm but not TIGR4 lgt::cm was significantly attenuated in epithelial adherence and microinvasion compared to their respective wild-type strains. To test the hypothesis that differential lipoprotein repertoires in TIGR4 and BHN418 lead to the intraspecies variation in epithelial microinvasion, we employed a motif-based genome analysis and identified an additional 525 a.a. lipoprotein (pneumococcal accessory lipoprotein A; palA) encoded by BHN418 that is absent in TIGR4. The gene encoding palA sits within a putative genetic island present in ~10% of global pneumococcal isolates. While palA was enriched in carriage and otitis media pneumococcal strains, neither mutation nor overexpression of the gene encoding this lipoprotein significantly changed microinvasion patterns. In conclusion, mutation of lgt attenuates epithelial inflammatory responses during pneumococcal-epithelial interactions, with intraspecies variation in the effect on microinvasion. Differential lipoprotein repertoires encoded by the different strains do not explain these differences in microinvasion. Rather, we postulate that post-translational modifications of lipoproteins may account for the differences in microinvasion.

Background: Improving outcomes from pneumococcal meningitis (PM), particularly in populations with high HIV prevalence, requires better understanding of host inflammatory responses to infection. Methods: We compared the transcriptome in pre-antibiotic cerebrospinal fluid (CSF) and blood from Malawian adults with PM using RNA sequencing. We used network analyses and cellular/process deconvolution of the transcriptome to identify important patho-physiological associations with outcome. Findings: Blood transcriptional profiles were obtained in 28 patients (21 HIV co-infected; median age 33 years [26-66]; median CSF WCC 28 cells/mm3 [0-3660]; median bacterial load 4.7x106 copies/ml CSF [671-2x109]; in-hospital mortality 64%), paired CSF profiles were obtained in 13. Marked differences in gene expression by outcome were confined to the CSF. In non-survivors, differentially expressed genes in the CSF were co-correlated in a network of pro-inflammatory gene-clusters enriched for collagen degradation and platelet degranulation. In contrast, CSF gene expression networks from surviving patients were dominated by DNA repair, transcriptional regulation and immunological signalling. CSF expression of gene response-modules for IL-17, Type 1 interferons and IL-10 were enriched in non-survivors, expression of cell-specific response-modules did not differ by outcome. However, genes for neutrophil chemotaxis and persistence were highly over-expressed in non-survivors. Interpretation: These data suggest poor outcome in PM is associated with over-expression of IL-17 and T1-IFN associated pro-inflammatory responses in the CSF and suggest a role for neutrophil-mediated inflammation. These responses are unlikely to be effected by current adjunctive treatments. Improving poor outcomes from PM will require better-targeted interventions.

Pneumococcal conjugate vaccines (PCV) have reduced pneumococcal diseases globally. Despite this, much remains to be learned about their effect on pathogen population structure. Here we undertook whole genome sequencing of 660 pneumococcal strains from asymptomatic carriers to investigate population restructuring in pneumococcal strains sampled before and after PCV13 introduction in a previously vaccine-naïve setting. We show substantial decreasing frequency of vaccine-type (VT) strains and their strain diversity post-vaccination in the vaccinated but not unvaccinated age groups indicative of direct but limited or delayed indirect effect of vaccination. Clearance of identical VT serotypes associated with multiple lineages occurred regardless of their genetic background. Interestingly, despite the increasing frequency of non-vaccine type (NVT) strains through serotype replacement, the serotype diversity was not fully restored to the levels observed prior to vaccination implying limited serotype replacement. The frequency of antibiotic resistant strains was low and remained largely unchanged post-vaccination but intermediate-penicillin-resistant lineages were reduced in the post vaccine population. Significant perturbations marked by changing frequency of accessory genes associated with diverse functions especially mobile genetic elements and bacteriocin activity were detected. This phylogenomic analysis demonstrates early vaccine-induced pneumococcal population restructuring not only at serotype but also accessory genome level.

Abstract Since the introduction of the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13) in Malawi in 2011, there has been persistent carriage of vaccine serotype (VT) Streptococcus pneumoniae , despite high vaccine coverage. To determine if there has been a genetic change within the VT capsule polysaccharide (cps) loci since the vaccine’s introduction, we compared 1,022 whole-genome-sequenced VT isolates from 1998 to 2019. We identified the clonal expansion of a multidrug-resistant, penicillin non-susceptible serotype 23F GPSC14-ST2059 lineage, a serotype 14 GPSC9-ST782 lineage and a novel serotype 14 sequence type GPSC9-ST18728 lineage. Serotype 23F GPSC14-ST2059 had an I253T mutation within the capsule oligosaccharide repeat unit polymerase Wzy protein, which is predicted in silico to alter the protein pocket cavity. Moreover, serotype 23F GPSC14-ST2059 had SNPs in the DNA binding sites for the cps transcriptional repressors CspR and SpxR. Serotype 14 GPSC9-ST782 harbour a non-truncated version of the large repetitive protein (Lrp), containing a Cna protein B-type domain which is also present in proteins associated with infection and colonisation. These emergent lineages also harboured genes associated with antibiotic resistance, and the promotion of colonisation and infection which were absent in other lineages of the same serotype. Together these data suggest that in addition to serotype replacement, modifications of the capsule locus associated with changes in virulence factor expression and antibiotic resistance may promote vaccine escape. In summary, the study highlights that the persistence of vaccine serotype carriage despite high vaccine coverage in Malawi may be partly caused by expansion of VT lineages post PCV13 rollout. Impact Statement Our findings highlight the potential for clonal expansion of multidrug-resistant, penicillin-non-susceptible vaccine serotype lineages with capsule locus modifications, within a high carriage and disease burden population. This shift has occurred among young children where there has been high vaccine coverage, posing challenges for effective vaccine scheduling and design. Furthermore, this study emphasises the importance of ongoing Streptococcus pneumoniae genomic surveillance as new or modified pneumococcal vaccines are implemented. 2. Data summary Whole genome sequencing assemblies for the PCVPA survey have been deposited in the BioProject PRJNA1011974.

Control of Streptococcus pneumoniae colonisation at human mucosal surfaces is critical to reducing the burden of pneumonia and invasive pneumococcal disease, interrupting transmission, and achieving herd protection. Using an Experimental Human Pneumococcal Carriage Model (EHPC), we show that S. pneumoniae colonisation is associated with epithelial surface adherence, micro-colony formation and invasion, without overt disease. Interactions between different strains and the epithelium in vitro shaped the host transcriptomic response. Using epithelial modules from a human epithelial cell model that recapitulates our in vivo findings, comprising of innate signalling/ regulatory pathways, inflammatory mediators, cellular metabolism and stress response genes, we find that inflammation in the EHPC model is most prominent around the time of bacterial clearance. These results show that rather than being confined to the epithelial surface and the overlying mucus layer, the pneumococcus undergoes micro-invasion of the epithelium that enhances the inflammatory/ innate immune response associated with clearance.