Summary The potential for variation and the capacity to evolve in response to ecological opportunity are important aspects of an adaptive radiation. Identifying the origin of phenotypic variation, in which natural selection might act upon, is a major goal of evolutionary developmental biology. The New World leaf-nosed bats (phyllostomids) are a textbook example of an adaptive radiation. Their cranial morphology is diverse along relative facial length, which is related to their diets. We previously used geometric morphometrics to reveal peramorphosis, a type of heterochrony, in the cranial evolution among phyllostomid bats. We then demonstrated that the mechanism of peramorphic diversity in phyllostomid rostrum length resulted from altered cellular proliferation. Here, we investigate the progenitors of the face, the cranial neural crest, and a key signaling pathway related to their proliferation and differentiation into mature tissues: the bone morphogenetic protein (BMP). With geometric morphometrics, immunofluorescence, and confocal imaging—in three phyllostomid species and one outgroup bat species—we show the molecular patterns that underlie the adaptive and innovative traits seen in phyllostomid bats. Then, with mouse genetics, we mimic the BMP molecular pattern observed in nectar feeding bats and recapitulate the elongated morphological variation in mice. Surprisingly, we also observe an expansion in the nose-tip of mice, akin to the expanding leaf-nose tissue in phyllostomid bats. These data, combined with the mouse genetics literature on BMP signaling, suggest the BMP developmental pathway plays a central role in shaping the craniofacial variation necessary for adaptation in bats. Further, we speculate that the BMP signaling pathway could underlie other bizarre facial phenotypes in mammals that are derived from frontonasal mesenchyme, such as the proboscis. Overall, this study combines a comparative framework to developmental data, with a genetic approach, to directly investigate the role of development on complex morphology.

Abstract Bats stand out among mammalian species for their exceptional traits, including the capacity to navigate through flight and echolocation, conserve energy through torpor/hibernation, harbor a multitude of viruses, exhibit resistance to disease, survive harsh environmental conditions, and demonstrate exceptional longevity compared to other mammals of similar size. In vivo studies of bats can be challenging for several reasons such as ability to locate and capture them in their natural environments, limited accessibility, low sample size, environmental variation, long lifespans, slow reproductive rates, zoonotic disease risks, species protection, and ethical concerns. Thus, establishing alternative laboratory models is crucial for investigating the diverse physiological adaptations observed in bats. Obtaining quality cells from tissues is a critical first step for successful primary cell derivation. However, it is often impractical to collect fresh tissue and process the samples immediately for cell culture due to the resources required for isolating and expanding cells. As a result, frozen tissue is typically the starting resource for bat primary cell derivation. Yet, cells in frozen tissue are usually damaged and represent low integrity and viability. As a result, isolating primary cells from frozen tissues poses a significant challenge. Herein, we present a successfully developed protocol for isolating primary dermal fibroblasts from frozen bat wing biopsies. This protocol marks a significant milestone, as this the first protocol specially focused on fibroblasts isolation from bat frozen tissue. We also describe methods for primary cell characterization, genetic manipulation of primary cells through lentivirus transduction, and the development of stable cell lines. Basic Protocol 1: Bat wing biopsy collection and preservation Support Protocol 1: Blood collection from bat-venipuncture Basic Protocol 2: Isolation of primary fibroblasts from adult bat frozen wing biopsy Support Protocol 2: Maintenance of primary fibroblasts Support Protocol 3: Cell banking and thawing of primary fibroblasts Support Protocol 4: Growth curve and doubling time Support Protocol 5: Lentiviral transduction of bat primary fibroblasts Basic Protocol 3: Bat stable fibroblasts cell lines development Support Protocol 6: Bat fibroblasts validation by immunofluorescence staining Support Protocol 7: Chromosome counting

Summary Specializations in animal diets drive selective demands on morphology, anatomy, and physiology. Studying adaptations linked to diet evolution benefits from examining Neotropical bats, a remarkable group with high taxonomic and trophic diversity. In this study, we performed glucose tolerance tests on wild-caught bats, which revealed distinct responses to three sugars present in different foods: trehalose (insects), sucrose, and glucose (fruits and nectar). Insect-eating bats metabolism responded most strongly to trehalose, while bats with nectar and fruit-based diets exhibited a heightened response to glucose and sucrose, reaching blood glucose levels over 600 and 750 mg/dL. To search for signatures of positive selection in sugar assimilation genes we performed genome analysis of 22 focal bat species and 2 outgroup species. We identified selection in the ancestral vespertilionid branch (insect-eaters) for the digestive enzyme trehalase, while sucrase-isomaltase exhibited selection in branches leading to omnivorous and nectar diets. Unexpectedly, the insect-eating lineage Myotis exhibited sucrase-isomaltase selection, potentially explaining their heightened sucrose assimilation. Furthermore, the genes encoding for glucose transporters, Slc2a3 and Slc2a2, showed selection in nectar and blood feeding bats, with analyses of predicted protein structures supporting modified activity. By examining cellular features of the small intestine, we discovered that dietary sugar proportion strongly impacted numerous digestive traits, providing valuable insight into the physiological implications of the identified molecular adaptations. To elucidate this further, we used HCR RNA-FISH to perform single molecule ex vivo gene expression analysis of enterocyte response to a glucose meal in three focal species. We observed unusually high activity in the glucose transporter Slc2a2 during the fasted state of nectar bats that did not change upon feeding. Comparatively, nectar bats exhibited an enhanced capacity for intestinal absorption of dietary sugar primarily through Slc2a2 , while fruit bats relied on increasing levels of Slc5a1 . Overall, this study highlights the intricate interplay between molecular, morphological, and physiological aspects of diet evolution and provides new insights into our understanding of dietary diversification and sugar assimilation mechanisms in mammals. Graphical Abstract Highlights Sugar assimilation differences emphasize metabolic adaptations to diet Glucose tolerance tests provide a quick and practical assessment of dietary ecology Bat genomes exhibit positive selection on digestive enzymes and glucose transporters Structural comparisons of proteins suggest altered activity of glucose transporters Glucose absorption differences can be explained by gut anatomy Intestinal villus diversity and novel microanatomy in bats Extreme blood glucose (above 600 and 750 mg/dL) coincides with constitutive expression of apical Slc2a2 The regulation of apical Slc2a2 highlights differences in blood glucose levels

Ataxin-7 (Atxn7), a subunit of the SAGA chromatin remodeling complex, is subject to polyglutamine expansion at the amino terminus, causing spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7), a progressive retinal and neurodegenerative disease. Within SAGA, the amino terminus of Atxn7 anchors the Non-stop deubiquitinase to the complex. To understand the consequences of Atxn7-dependent regulation of Non-stop, we sought substrates for Non-stop and discovered the deubiquitinase, dissociated from SAGA, interacts with Arp2/3 and WAVE regulatory complexes (WRC). Protein levels of WRC subunit suppressor of extracellular cAMP receptor (cAR) (SCAR) are regulated by a constant ubiquitination/proteasomal degradation mechanism. Loss of Atxn7 frees Non-stop from SAGA, leading to increased Non-stop interaction with SCAR and also increased SCAR protein levels. A Non-stop enzymatic pocket mutation that increases binding to ubiquitin increased interaction with SCAR, while an enzymatic pocket mutation reducing binding to ubiquitin also reduced binding to SCAR. Loss of Non-stop increased polyubiquitination of SCAR and reduced SCAR protein levels although SCAR protein levels were rescued by protease inhibition. Dependent on conserved WRC interacting receptor sequences (WIRS), Non-stop overexpression increased SCAR protein levels and directed subcellular localization of SCAR, leading to decreased cell area and decreased number of protrusions. In vivo , heterozygous mutation of Atxn7 rescued haploinsufficiency of SCAR to produce F actin, but heterozygous mutation of SCAR did not significantly rescue retinal axon mistargeting upon knockdown of Atxn7.Summary SAGA subunits Ataxin-7 and Non-stop regulate stability and subcellular localization of WRC subunit SCAR. Loss of Ataxin-7 increases, while loss of Non-stop decreases, SCAR protein levels and F-actin network assembly.

Abstract Lateral flight membranes, or patagia, have evolved repeatedly in diverse mammalian lineages. While little is known about patagium development, its recurrent evolution may suggest a shared molecular basis. By combining transcriptomics, developmental experiments, and mouse transgenics, we demonstrate that lateral WNT5A expression in the marsupial sugar glider ( Petaurus breviceps ) promotes the differentiation of its patagium primordium. We further show that this function of WNT5A reprises ancestral roles in skin morphogenesis predating mammalian flight and has been convergently employed during patagium evolution in eutherian bats. Moreover, we find that many genes involved in limb development have been re-deployed during patagium outgrowth in both the sugar glider and bat. Taken together, our findings reveal that deeply conserved molecular toolkits underpin the evolutionary transition to flight in mammals.