Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a lethal disease characterized by high invasiveness, therapeutic resistance, and metabolic aberrations. Although altered metabolism drives PDA growth and survival, the complete spectrum of metabolites used as nutrients by PDA remains largely unknown. Here, we aimed to determine novel nutrients utilized by PDA. We assessed how >175 metabolites impacted metabolic activity in 19 PDA cell lines under nutrient-restricted conditions. This analysis identified uridine as a novel metabolite driver of PDA survival in glucose-deprived conditions. Uridine utilization strongly correlated with expression of the enzyme uridine phosphorylase 1 (UPP1). Metabolomics profiling, notably 13 C-stable isotope tracing, revealed that uridine-derived ribose is the relevant component supporting redox balance, survival, and proliferation in glucose-deprived PDA cells. We demonstrate that UPP1 catabolizes uridine, shunting its ribose component into central carbon metabolism to support glycolysis, the tricarboxylic acid (TCA) cycle and nucleotide biosynthesis. Compared to non-tumoral tissues, we show that PDA tumors express high UPP1 , which correlated with poor overall survival in multiple patient cohorts. Further, uridine is enriched in the pancreatic tumor microenvironment, and we demonstrate that this may be provided in part by tumor associated macrophages. Finally, we found that inhibition of UPP1 restricted the ability of PDA cells to use uridine, and that UPP1 knockout impairs tumor growth in vivo . Our data identifies uridine catabolism as a critical aspect of compensatory metabolism in nutrient-deprived PDA cells, suggesting a novel metabolic axis for PDA therapy.

ABSTRACT The tumor microenvironment (TME) in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) restricts vascularization and, consequently, access to blood-derived nutrients and oxygen, which impacts tumor growth. Intracellular redox imbalance is another restraint on cellular proliferation, yet it is unknown if the TME contributes to the maintenance of redox homeostasis in PDA cells. Here, we demonstrate that the loss of mitochondrial glutamate-oxaloacetate transaminase 2 (GOT2), a component in the malate-aspartate shuttle, disturbs redox homeostasis and halts proliferation of PDA cells in vitro. In contrast, GOT2 inhibition has no effect on in vivo tumor growth or tumorigenesis in an autochthonous model. We propose that this discrepancy is explained by heterocellular pyruvate exchange from the TME, including from cancer associated fibroblasts. More broadly, pyruvate similarly confers resistance to inhibitors of mitochondrial respiration. Genetic or pharmacologic inhibition of pyruvate uptake or metabolism abrogated pyruvate-mediated alleviation of reductive stress from NADH buildup. In sum, this work describes a potential resistance mechanism mediated by metabolic crosstalk within the pancreatic TME. These findings have important implications for metabolic treatment strategies since several mitochondrial inhibitors are currently in clinical trials for PDA and other cancers.

Summary To identify novel drivers of malignancy in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), we employed regulatory network analysis, which calculates the activity of transcription factors and other regulatory proteins based on the integrated expression of their positive and negative target genes. We generated a regulatory network for the malignant epithelial cells of human PDAC using gene expression data from a set of 197 laser capture microdissected human PDAC samples and 45 low-grade precursors, for which we had matched histopathological, clinical, and epidemiological annotation. We then identified the most highly activated and repressed regulatory proteins (e.g. master regulators or MRs) associated with four malignancy phenotypes: precursors vs. PDAC (initiation), low-grade vs. high grade histopathology (progression), survival post resection, and association with KRAS activity. Integrating across these phenotypes, the top MR of PDAC malignancy was found to be BMAL2, a member of the PAS family of bHLH transcription factors. Although the canonical function of BMAL2 is linked to the circadian rhythm protein CLOCK, annotation of BMAL2 target genes highlighted a potential role in hypoxia response. We previously demonstrated that PDAC is hypovascularized and hypoperfused, and here show that PDAC from the genetically engineered KPC model exists in a state of extreme hypoxia, with a partial oxygen pressure of <1mmHg. Given the close homology of BMAL2 to HIF1β (ARNT) and its potential to heterodimerize with HIF1A and HIF2A, we investigated whether BMAL2 plays a role in the hypoxic response of PDAC. Indeed, BMAL2 controlled numerous hypoxia response genes and could be inhibited following treatment with multiple RAF, MEK, and ERK inhibitors, validating its association with RAS activity. Knockout of BMAL2 in four human PDAC cell lines led to defects in growth and invasion in the setting of hypoxia. Strikingly, BMAL2 null cells failed to induce glycolysis upon exposure to severe hypoxia and this was associated with a loss of expression of the glycolytic enzyme LDHA. Moreover, HIF1A was no longer stabilized under hypoxia in BMAL2 knockout cells. By contrast, HIF2A was hyper-stabilized under hypoxia, indicating a dysregulation of hypoxia metabolism in response to BMAL2 loss. We conclude that BMAL2 is a master regulator of hypoxic metabolism in PDAC, serving as a molecular switch between the disparate metabolic roles of HIF1A- and HIF2A-dependent hypoxia responses. Statement of Significance There is a surprising disconnect between the genomic alterations present in pancreatic ductal adenocarcinoma and key phenotypes of malignancy, suggesting that non-genetic factors must play a role. Here we analyze changes in regulatory state – calculated from network analysis of RNA expression data – to identify transcription factors and other regulatory proteins whose activities drive pancreatic cancer malignancy. We identified the top candidate, BMAL2, as a novel, KRAS-responsive regulator of hypoxic response in pancreatic cancer, serving as a switch between HIF1A and HIF2A expression. These data help explain how KRAS coordinates cell regulatory state to enable tumor cells to survive extreme hypoxia, and highlight the ability of regulatory network analysis to identify overlooked, key drivers of biological phenotypes.

Abstract Heart failure (HF) is defined as an inability of the heart to pump blood adequately to meet the body’s metabolic demands. HF with reduced systolic function is characterized by cardiac hypertrophy, ventricular fibrosis and remodeling, and decreased cardiac contractility, leading to cardiac functional impairment and death. Transverse aortic constriction (TAC) is a well-established model for inducing hypertrophy and HF in rodents. Mice globally deficient in sirtuin 5 (SIRT5), a NAD + -dependent deacylase, are hypersensitive to cardiac stress and display increased mortality after TAC. Prior studies assessing SIRT5 functions in the heart have all employed loss-of-function approaches. In this study, we generated SIRT5 overexpressing (SIRT5OE) mice, and evaluated their response to chronic pressure overload induced by TAC. Compared to littermate controls, SIRT5OE mice were protected from left ventricular dilation and impaired ejection fraction, adverse functional consequences of TAC. Transcriptomic analyses revealed that SIRT5 suppresses key HF sequelae, including the metabolic switch from fatty acid oxidation to glycolysis, immune activation, and increased fibrotic signaling. We conclude that SIRT5 is a limiting factor in the preservation of cardiac function in response to experimental pressure overload.

Abstract Cellular metabolism is essential in dictating conventional T cell development and function, but its role in natural killer T (NKT) cells has not been well studied. We have previously shown that NKT cells operate distinctly different metabolic programming from CD4 T cells, including a strict requirement for glutamine metabolism to regulate NKT cell homeostasis. However, the mechanisms by which NKT cells regulate glutamine metabolism for their homeostasis and effector functions remain unknown. In this study, we report that steady state NKT cells have higher glutamine levels than CD4 T cells and NKT cells increase glutaminolysis upon activation. Among its many metabolic fates, NKT cells use glutamine to fuel the tricarboxylic acid cycle and glutathione synthesis, and glutamine-derived nitrogen enables protein glycosylation via the hexosamine biosynthesis pathway (HBP). Each of these functions of glutamine metabolism was found to be critical for NKT cell survival and proliferation. Furthermore, we demonstrate that glutaminolysis and the HBP differentially regulate IL-4 and IFNγ production. Finally, glutamine metabolism appears to be controlled by AMP-activated protein kinase (AMPK)-mTORC1 signaling. These findings highlight a unique metabolic requirement of NKT cells which can be potentially serve as an effective immunotherapeutic agent against certain nutrient restricted tumors. Significance NKT cells get activated very early during an immune response and produce cytokines and chemokines, which further activate other immune cell types. Although metabolism regulates these functions in other T cell subsets, little is understood about how metabolic pathways are controlled in NKT cells. The present study shows that NKT cells metabolize the amino acid glutamine through two different branches of metabolism, which control NKT cell homeostasis and expansion in a similar manner but control cytokine production differently. This glutamine dependency seems to be regulated by AMP-activated protein kinase (AMPK), which is a central regulator of energy homeostasis. Together, our study demonstrates a unique metabolic profile of glutamine metabolism in NKT cells which could be harnessed for NKT cell-based immunotherapy.

Abstract It is projected that, in 5 years, pancreatic cancer will become the second deadliest cancer in the United States. A unique aspect of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is its stroma; rich in cancer-associated fibroblasts (CAFs) and a dense CAF-generated extracellular matrix (ECM). This fibrous stroma, known as desmoplasia, causes the collapse of local blood vessels rendering a nutrient-deprived milieu. Hence, PDAC cells are nurtured by local CAF-secreted products, which include, among others, CAF-generated small extracellular vesicles (sEVs). It is well-accepted that upon culturing functionally tumor-promoting CAFs under pathophysiological-relevant conditions (e.g., within self-produced ECM), these cells express NetrinG1 (NetG1) and sustain endosomal pools rich in active α5β1-integrin; traits indicative of poor patient survival. We herein report that NetG1 + CAFs generate sEVs that rescue PDAC cells from nutrient-deprived induced apoptosis. Two unique sEVs, NetG1 + and α5β1-integrin + , were uncovered. The former constitutes cargo of CAF-generated exomeres, and the latter is detected in classic exosomes. Proteomic and metabolomic analyses showed that the sEV-dependent PDAC survival is, at least in part, dictated by the cargo packaged within sEVs in a NetG1-dependent manner. Indeed, despite producing a similar number of vesicles, selected key proteins and metabolites (e.g., glutamine) were incorporated within the unique sEVs. Finally, we found that NetG1 and α5β1-integrin were detected in sEVs collected from plasma of PDAC patients, while their concomitant levels were significantly lower in plasma of sex/age-matched healthy donors. The discovery of these tumor-supporting CAF sEVs opens a new investigative avenue in tumor-stroma interactions and stroma staging detection.

Abstract Personalized oncology aims to match effective treatments for individual cancer patients based on the biology of an individual tumor. This approach is not possible for metabolic therapies due to our inability to quantify metabolic activity in patient tumors, even when patients are infused with 13C-glucose. We overcame this challenge by generating training data with a prior knowledge of 13C-glucose infused patient data and implementing a machine learning model to predict fluxes. We trained a convolutional neural network (CNN) to predict flux ratios. To validate our model, we compared predicted flux ratios to the experimental 13C-glucose-infused mouse models to predict treatment responses for: (1) pharmacologic inhibition of de novo GMP synthesis and (2) environmental serine restriction. Our GMP synthesis model predicted elevated GMP synthesis in GBM compared to cortex in a mouse model and discriminated between sources of GMP synthesis in patients. These findings allow prediction of potential responders to mycophenolate mofetil (MMF), which inhibits de novo but not salvage GMP synthesis. Furthermore, we previously showed that circulating serine uptake is higher in GBM than normal cortex, and a serine- and glycine-restricted diet slows tumor growth in mice. While de novo serine synthesis, circulating and microenvironmental-derived serine could account for serine sources in GBM, our model can distinguish between serine sources in patients, hence potentially predict response to dietary serine depletion. Thus, we have shown that our model may identify patients who will benefit from MMF treatment or a serine- and glycine-restricted diet, potentially enabling administration of highly effective personalized metabolic treatments for GBM patients.

Hydrogen sulfide exposure in moderate doses can induce profound but reversible hypometabolism in mammals. At a cellular level, H2S inhibits the electron transport chain (ETC), augments aerobic glycolysis, and glutamine-dependent carbon utilization via reductive carboxylation; however, the durability of these changes is unknown. We report that despite its volatility, H2S preconditioning increases P50(O2), the O2 pressure for half maximal cellular respiration, and has pleiotropic effects on oxidative metabolism that persist up to 24-48 h later. Notably, cyanide, another complex IV inhibitor, does not induce this type of metabolic memory. Sulfide-mediated prolonged fractional inhibition of complex IV by H2S is modulated by sulfide quinone oxidoreductase, which commits sulfide to oxidative catabolism. Since induced hypometabolism can be beneficial in disease settings that involve insufficient or interrupted blood flow, our study has important implications for attenuating reperfusion-induced ischemic injury, and/or prolonging shelf life of biologics like platelets.

Photoreceptor loss results in vision loss in many blinding diseases, and metabolic dysfunction underlies photoreceptor degeneration. So, exploiting photoreceptor metabolism is an attractive strategy to prevent vision loss. Yet, the metabolic pathways that maintain photoreceptor health remain largely unknown. Here, we investigated the dependence of photoreceptors on Gln catabolism. Gln is converted to glutamate via glutaminase (GLS), so mice lacking GLS in rod photoreceptors were generated to inhibit Gln catabolism. Loss of GLS produced rapid rod photoreceptor degeneration. In vivo metabolomic methodologies and metabolic supplementation identified Gln catabolism as critical for glutamate and aspartate biosynthesis. Concordant with this amino acid deprivation, the integrated stress response (ISR) was activated with protein synthesis attenuation, and inhibiting the ISR delayed photoreceptor loss. Furthermore, supplementing asparagine, which is synthesized from aspartate, delayed photoreceptor degeneration. Hence, Gln catabolism is integral to photoreceptor health, and these data reveal a novel metabolic axis in these metabolically-demanding neurons.

Abstract Mitophagy is a cargo-specific autophagic process that recycles damaged mitochondria to promote mitochondrial turnover. PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) mediates the canonical mitophagic pathway. We show that PINK1 expression is positively correlated with decreased colon cancer survival, and mitophagy is required for colon cancer growth following nutrient stress. However, the mechanism by which PINK1 maintains colon cancer growth remains equivocal. Inducible knockdown (KD) of PINK1 in a panel of colon cancer cell lines inhibited colon cancer cell proliferation, whereas disruption of other mitophagy receptors did not similarly impact cellular proliferation. Mechanistically, we observed a decrease in mitochondrial respiration, membrane hyperpolarization, accumulation of mitochondrial DNA, and depletion of antioxidant glutathione following PINK1 KD. Mitochondria are important hubs for storing iron and synthesizing iron-dependent cofactors such as heme and iron sulfur clusters. An increase iron storage protein ferritin and a decrease labile iron pool was observed in PINK1 KD cells. However, neither total cellular iron nor markers of iron starvation/overload were affected. Cellular iron storage and the labile iron pool are maintained via autophagic degradation of ferritin (ferritinophagy). Overexpressing nuclear receptor coactivator 4 (NCOA4), a key adaptor for ferritinophagy, rescued cell growth and the labile iron pool in PINK1 KD cells. We demonstrate that PINK1 regulates intracellular iron availability by integrating mitophagy to ferritinophagy. In conclusion, these results indicate that PINK1 is essential for maintaining intracellular iron homeostasis to support survival and growth in colorectal cancer cells.