Abstract Leucine-rich repeat-containing G-protein receptor 5 (LGR5) has been characterised as a stem cell and cancer stem cell marker. Previous analyses of LGR5 transcript levels indicate high level expression discriminates malignancies such as colorectal cancer (CRC) and pre-B acute lymphoblastic leukaemia (pre-B ALL) from healthy tissues suggesting LGR5 protein expression may provide a molecular handle for prognosis and treatment. We have developed highly specific, high affinity antibodies to the extracellular domain of human LGR5 (α-LGR5) that detect high LGR5 protein levels in colorectal cancer (CRC), hepatocellular carcinoma (HCC), and pre-B ALL. In contrast, there is low to undetectable levels of LGR5 protein in normal colon and rectal epithelia, liver, ovarian tissues, brain and immune cell types. LGR5 is rapidly internalised from the plasma membrane and trafficked to intracellular vesicular compartments including lysosomes. Treatment of high LGR5-expressing CRC and pre-B ALL cancer cell lines with an antibody-drug conjugate version of α-LGR5 (α-LGR5-ADC) lead to effective cell killing at nanomolar concentrations. Interventional treatment of pre-B ALL tumours with α-LGR5-ADC in vivo led to rapid tumour attrition. We further demonstrated the therapeutic utility of humanised α-LGR5 by using the corresponding scFv fragment for the generation of α-LGR5 chimeric antigen receptors (CARs) and a Bispecific T cell Engager (BiTE). α-LGR5-CAR-NK cells were effective at killing LGR5-expressing cells while α-LGR5/α-CD3 BiTEs induce T cell activation and killing of NALM6 cells by cytotoxic CD8 + T cells. Taken together, this study establishes α-LGR5-based therapeutic modalities that effectively discriminate and target CRC, HCC and pre-B ALL tumour cells. One Sentence Summary We generated novel antibodies against the cancer cell marker LGR5, validated diagnostic use in prioritizing specific cancer types for targeting, and developed antibody-based therapeutics.

Abstract Loss-of-function mutations in the gene encoding the acetyltransferase CREBBP have been reported in numerous cancers but are particularly frequent in lymphoid malignancies. However, the functional significance of CREBBP loss in transformation and disease progression, most likely through cooperation with secondary genetic hits, has not yet been fully unravelled. Similarly, the contribution of the initial cell population sustaining CREBBP loss in the course of disease remains elusive. Here, we developed a new lymphoma mouse model integrating Crebbp loss at various stages of B cell development with a transposon-based insertional mutagenesis system. We demonstrated that Crebbp loss from the HSPC compartment resulted in an aggressive DLBCL-like disease, recapitulating well-characterised histological and molecular features of the human disease, as well as the recently described enhanced CD24 expression. More importantly, we identified candidate genes functionally equivalent to patient mutated genes. Those genes, mainly related to B cell development and cellular signalling, may represent novel therapeutic targets. Overall, this new model provides a powerful resource in which to conduct future mechanistic and therapeutic studies.

ABSTRACT Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous disease of dismal prognosis, with vulnerabilities in epigenetic and metabolic regulation. DNA demethylating agents, e.g. azacytidine (AZA), are used as first-line therapy in AML patients unable to tolerate intensive chemotherapy regimens, often in combination with BCL-2 inhibitor venetoclax. However, the impact on survival is limited, indicating the need for alternative therapeutic strategies. Methyl-group usage for epigenetic modifications depends on methionine availability and MAT2A-driven conversion to S-adenosyl-methionine. Methyl-group production is a vulnerability in multiple tumours, including AML, and has been variably linked to impairment of different histone methyl-modifications. In contrast, we herein align MAT2A effects in AML with DNA methylation and proteostasis. We show that MAT2A inhibition can be mimicked by combining AZA with unfolded protein response (UPR) activation through targeting of valosin-containing protein (VCP)/P97. Combined AZA and P97 inhibition exceeded AZA-driven restriction of human AML cell expansion, and specifically impaired colony-formation and maintenance of CD34+ patient blasts, suggesting targeting of AML stem/progenitor-like cells. Overall, our data support combined targeting of DNA methylation and the UPR as a promising therapeutic strategy in AML.

B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is a leading cause of death in childhood and outcomes in adults remain dismal. There is therefore an urgent clinical need for therapies that target the highest risk cases. Mutations in the histone acetyltransferase CREBBP associate with high-risk features in B-ALL and have been implicated in chemoresistance. We performed a targeted drug screen in isogenic human cell lines, identifying a number of actionable small molecules that specifically target CREBBP-mutated B-ALL. The most potent was the BCL2 inhibitor Venetoclax, which acts through a non-canonical mechanism resulting in ferroptotic cell death. CREBBP-mutated cell lines showed differences in cell-cycle, metabolism and response to oxidative stress. Lastly, we demonstrate that small-molecule inhibition of CREBBP sensitizes B-ALL cells, regardless of genotype, to Venetoclax-induced ferroptosis in-vitro and in-vivo, providing a potential novel drug combination for broader clinical translation in B-ALL.

Acute Myeloid Leukemia (AML) is an aggressive hematological malignancy with abnormal progenitor self-renewal and defective myelo-monocytic differentiation. Its pathogenesis comprises subversion of transcriptional regulation, through mutation and by hijacking normal chromatin regulation. Kat2a is a histone acetyltransferase central to promoter activity, that we recently associated with stability of pluripotency networks, and identified as a genetic vulnerability in AML. Through combined chromatin profiling and single-cell transcriptomics, we demonstrate that Kat2a contributes to leukemia propagation through homogeneity of transcriptional programs and preservation of leukemia stem-like cells. Kat2a loss reduces transcriptional bursting frequency in a subset of gene promoters, generating enhanced variability of transcript levels but minimal effects on mean gene expression. Destabilization of target programs shifts cellular equilibrium out of self-renewal towards differentiation. We propose that control of transcriptional variability is central to leukemia stem-like cell propagation, and establish a paradigm exploitable in different tumors and at distinct stages of cancer evolution.

Abstract Interactions between transcription factors (TF) and chromatin factors (CF) regulate gene expression programmes to determine cellular fate. However, unlike for TF, the exact role of CF in this process is poorly understood. Using haematopoiesis as a model system and utilising novel functional CRISPR screens ex vivo and in vivo , coupled with Perturb-Seq, CF binding and genome-wide chromatin accessibility in primary murine cells, we assess the role of 550 chromatin factors in lineage choice in normal haematopoiesis and the maintenance of acute myeloid leukaemia (AML). These studies demonstrate marked specificity for a large number of CFs in lineage determination, highlighting functional diversity within specific families of chromatin regulators, including MLL-H3K4-methyltransferases and different BAF-complexes, that regulate disparate lineage decisions across haematopoiesis. Conversely, we demonstrate that unrelated Repressive complexes function similarly to restrain excessive myeloid differentiation and protect lineage diversity. We identify interactions between CF and TF that, at least in part, explain the regulatory function of CF and link Brd9- loss to a premalignant state. Utilising similar experiments in a relevant murine AML model, we demonstrate opposing effects for CF in normal haematopoiesis and AML, where MLL-H3K4-methyltransferases, c-BAF-remodelers and Repressive complexes prevent differentiation and maintain leukaemic fitness. We show that this alteration relates to differential utilisation of TF by CF complexes between normal and malignant haematopoiesis, highlighting corrupted TF-CF interactions as potential novel avenues for therapeutic intervention in AML. Together, this study provides novel insights on the functional diversity of chromatin factors in governing cell-fate.