Abstract Cells must coordinate their metabolism and fate trajectories ( 1, 2 ), but the underlying mechanisms are only beginning to be discovered. To understand why the glycolytic enzyme enolase 1 (ENO1) binds RNA ( 3–6 ), we studied this phenomenon in vitro, in human cells, and during mouse embryonic stem cell differentiation. We find specific cellular RNA ligands that inhibit ENO1’s enzymatic activity in vitro. Increasing the concentration of these ligands in cultured cells inhibits glycolysis. We demonstrate that pluripotent stem cells expressing an ENO1 mutant that is hyper-inhibited by RNA are severely impaired in their glycolytic capacity and in endodermal differentiation, whereas cells with an RNA binding-deficient ENO1 mutant display disproportionately high endodermal marker expression. Our findings uncover ENO1 riboregulation as a novel form of metabolic control. They also describe an unprecedented mechanism involved in the regulation of stem cell differentiation. One Sentence Summary RNA directly regulates enzyme activity to control metabolism and stem cell fate

ABSTRACT TRIM25 is a ubiquitin E3 ligase active in innate immunity and cell fate decisions. Mounting evidence suggests that TRIM25′s E3 ligase activity is regulated by RNAs. However, while mutations affecting RNA binding have been described, neither the precise RNA binding site has been identified nor which domains are involved. Here, we present biophysical evidence for the presence of RNA binding sites on both TRIM25 PRY/SPRY and coiled-coil domains, and map the binding site on the PRY/SPRY with residue resolution. Cooperative RNA-binding of both domains enhances their otherwise transient interaction in solution and increases the E3 ligase activity of TRIM25. We also show that TRIM25 not only binds RNA in mammalian cells but that interfering with RNA binding has an effect on cellular RIG-I ubiquitination.

Abstract Dynein and kinesin motors mediate long-range intracellular transport, translocating towards microtubule minus and plus ends, respectively. Cargoes often undergo bidirectional transport by binding to both motors simultaneously. However, it is not known how motor activities are coordinated in such circumstances. In Drosophila , sequential activities of the dynein-dynactin-BicD-Egalitarian (DDBE) complex and of kinesin-1 deliver oskar mRNA from nurse cells to the oocyte, and within the oocyte to the posterior pole. Here, through in vitro reconstitution, we show that Tm1-I/C, a Tropomyosin-1 isoform, links kinesin-1 in an inactive state to DDBE-associated oskar mRNA. NMR spectroscopy, small-angle X-ray scattering and structural modeling indicate that Tm1-I/C suppresses kinesin-1 activity by stabilizing its autoinhibited conformation, thus preventing a tug-of-war between the opposite polarity motors until kinesin-1 is activated in the oocyte. Our work reveals a novel strategy ensuring sequential activity of microtubule motors.

Abstract RNA binding proteins (RBPs) take part in all steps of the RNA life cycle and are often essential for cell viability. Most RBPs have a modular organization and comprise a set of canonical RNA binding domains. However, in recent years a number of high-throughput mRNA interactome studies on yeast, mammalian cell lines and whole organisms have uncovered a multitude of novel mRNA interacting proteins that lack classical RNA binding domains. Whereas a few have been confirmed to be direct and functionally relevant RNA binders, biochemical and functional validation of RNA binding of most others is lacking. In this study, we employed a combination of NMR spectroscopy and biochemical studies to test the RNA binding properties of six putative RNA binding proteins. Half of the analysed proteins showed no interaction, whereas the other half displayed weak chemical shift perturbations upon titration with RNA. One of the candidates we found to interact weakly with RNA in vitro is Drosophila melanogaster End binding protein 1 (EB1), a master regulator of microtubule plus-end dynamics. Further analysis showed that EB1’s RNA binding occurs on the same surface as that with which EB1 interacts with microtubules. RNA immunoprecipitation and colocalization experiments suggest that EB1 is a rather non-specific, opportunistic RNA binder. Our data suggest that care should be taken when embarking on an RNA binding study involving these unconventional, novel RBPs, and we recommend initial and simple in vitro RNA binding experiments.

ABSTRACT Macroautophagy ensures the clearance of intracellular substrates ranging from single ubiquitinated proteins to large proteotoxic aggregates and defective organelles. The selective autophagy receptor p62 binds these targets and recruits them to double-membrane vesicles, which fuse with lysosomes to degrade their content. We recently uncovered that p62 function is riboregulated by the small non-coding vault RNA1-1. Here, we present detailed insight into the underlying mechanism. We show that the PB1 domain and adjacent linker region of p62 (aa 1-122) are necessary and sufficient for specific vault RNA1-1 binding, and identify lysine 7 and arginine 21 as key hinges for p62 riboregulation. Chemical structure probing of vault RNA1-1 further reveals a central flexible loop within the RNA that mediates the specific p62 interaction. Our data define molecular determinants that govern mammalian autophagy via the p62-vault RNA1-1 riboregulatory pair.

Abstract Severe heat stress causes massive loss of essential proteins by aggregation necessitating a cellular activity that rescues aggregated proteins. This activity is executed by ATP-dependent, ring-forming, hexameric AAA+ disaggregases. Little is known about the recognition principles of stress-induced protein aggregates. How can disaggregases specifically target aggregated proteins while avoiding binding to soluble non-native proteins? Here, we determined by NMR spectroscopy the core structure of the aggregate targeting N1 domain of the bacterial AAA+ disaggregase ClpG, which confers extreme heat resistance to bacteria. N1 harbors a Zn 2+ -coordination site that is crucial for structural integrity and disaggregase functionality. Conserved hydrophobic N1 residues located on a β-strand were found crucial for aggregate targeting and disaggregation activity. Mixing experiments with N1-truncated AAA+ hexamers revealed that a minimal number of four N1 domains must be present in a AAA+ ring for high disaggregation activity. We suggest that multiple N1 domains increase substrate affinity through avidity effects. These findings define the recognition principle of a protein aggregate by a disaggregase, involving simultaneous contacts with multiple hydrophobic substrate patches located in close vicinity on an aggregate surface. This binding mode ensures selectivity for aggregated proteins while sparing soluble, non-native protein structures from disaggregase activity.

Maleless (MLE) is an evolutionary conserved member of the DExH family of helicases in Drosophila. Besides its function in RNA editing and presumably siRNA processing, MLE is best known for its role in remodelling non-coding roX RNA in the context of X chromosome dosage compensation in male flies. MLE and its human orthologue, DHX9 contain two tandem double-stranded RNA binding domains (dsRBDs) located at the N-terminal region. The two dsRBDs are essential for localization of MLE at the X-territory and it is presumed that this involves binding roX secondary structures. However, for dsRBD1 roX RNA binding has so far not been described. Here, we determined the solution NMR structure of dsRBD1 and dsRBD2 of MLE in tandem and investigated its role in double-stranded RNA (dsRNA) binding. Our NMR data show that both dsRBDs act as independent structural modules in solution and are canonical, non-sequence-specific dsRBDs featuring non-canonical KKxAK RNA binding motifs. NMR titrations combined with filter binding experiments document the contribution of dsRBD1 to dsRNA binding in vitro. Curiously, dsRBD1 mutants in which dsRNA binding in vitro is strongly compromised do not affect roX2 RNA binding and MLE localization in cells. These data suggest alternative functions for dsRBD1 in vivo.

Summary RNA-binding proteins are essential for gene regulation and the spatial organization of cells. Here, we report that the yeast ribosome biogenesis factor Loc1p is an intrinsically disordered RNA-binding protein with eight repeating p ositively charged, u nstructured n ucleic acid binding (PUN) motifs. While a single of these previously undefined motifs stabilizes folded RNAs, multiple copies strongly cooperate to catalyze RNA folding. In the presence of RNA, these multivalent PUN motifs drive phase separation. Proteome-wide searches in pro-and eukaryotes for proteins with similar arrays of PUN motifs reveal a strong enrichment in RNA-mediated processes and DNA remodeling. Thus, PUN motifs are potentially involved in a large variety of RNA-and DNA-related processes by concentrating them in membrane-less organelles. The general function and wide distribution of PUN motifs across species suggests that in an ancient “RNA world” PUN-like motifs may have supported the correct folding of early ribozymes.

Summary Unwinding RNA secondary structures by RNA helicases is essential for RNA metabolism. How the basic unwinding reaction of DExH-type helicases is regulated by their accessory domains is unresolved. Here, we combine structural and functional analyses to address this challenge for the prototypic DExH RNA helicase maleless (MLE) from Drosophila . We captured the helicase cycle of MLE with multiple structural snapshots. We discovered that initially, dsRBD2 flexibly samples substrate dsRNA and aligns it with the open helicase tunnel. Subsequently, dsRBD2 releases RNA and associates with the helicase core, leading to closure of the tunnel around ssRNA. Structure-based MLE mutations confirm the functional relevance of the structural model in cells. We propose a molecular model in which the dsRBD2 domain of MLE orchestrates large structural transitions that depend on substrate RNA but are independent of ATP. Our findings reveal the fundamental mechanics of dsRNA unwinding by DExH helicases with high general relevance for dosage compensation and specific implications for MLE’s human orthologue DHX9/RHA mechanisms in disease.

ABSTRACT RNA binding proteins (RBPs) often engage multiple RNA binding domains (RBDs) to increase target specificity and affinity. However, the complexity of target recognition of multiple RBDs remains largely unexplored. Here we use Upstream of N-Ras (Unr), a multidomain RBP, to demonstrate how multiple RBDs orchestrate target specificity. A crystal structure of the three C-terminal RNA binding cold-shock domains (CSD) of Unr bound to a poly(A) sequence exemplifies how recognition goes beyond the classical π-π-stacking in CSDs. Further structural studies reveal several interaction surfaces between the N-terminal and C-terminal part of Unr with the poly(A)-binding protein (pAbp). This provides first atomistic details towards understanding regulation of translation initiation that is mediated by the interplay of these two proteins with each other and RNA.