Heterozygous mutations of the gene encoding the postsynaptic protein SHANK3 are associated with syndromic forms of autism spectrum disorders (ASDs). One of the earliest clinical symptoms in SHANK3-associated ASD is neonatal skeletal muscle hypotonia. This symptom can be critical for the early diagnosis of affected children; however, the mechanism mediating hypotonia in ASD is not completely understood. Here, we used a combination of patient-derived human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), Shank3Δ11(-/-) mice, and Phelan-McDermid syndrome (PMDS) muscle biopsies from patients of different ages to analyze the role of SHANK3 on motor unit development. Our results suggest that the hypotonia in SHANK3 deficiency might be caused by dysfunctions in all elements of the voluntary motor system: motoneurons, neuromuscular junctions (NMJs), and striated muscles. We found that SHANK3 localizes in Z-discs in the skeletal muscle sarcomere and co-immunoprecipitates with α-ACTININ. SHANK3 deficiency lead to shortened Z-discs and severe impairment of acetylcholine receptor clustering in hiPSC-derived myotubes and in muscle from Shank3Δ11(-/-) mice and patients with PMDS, indicating a crucial role for SHANK3 in the maturation of NMJs and striated muscle. Functional motor defects in Shank3Δ11(-/-) mice could be rescued with the troponin activator Tirasemtiv that sensitizes muscle fibers to calcium. Our observations give insight into the function of SHANK3 besides the central nervous system and imply potential treatment strategies for SHANK3-associated ASD.

Summary In neurological conditions affecting the brain, early-stage neural circuit adaption is key for long-term preservation of normal behaviour. We tested if motoneurons and respective microcircuits also adapt in the initial stages of disease progression in a mouse model of progressive motoneuron degeneration. Using a combination of in vitro and in vivo electrophysiology and super-resolution microscopy, we found that, preceding muscle denervation and motoneuron death, recurrent inhibition mediated by Renshaw cells is reduced in half due to impaired quantal size associated with decreased glycine receptor density. Additionally, higher probability of release from proprioceptive Ia terminals leads to increased monosynaptic excitation to motoneurons. Surprisingly, the initial impairment in recurrent inhibition is not a widespread feature of inhibitory spinal circuits, such as group I inhibitory afferents, and is compensated at later stages of disease progression. We reveal that in disease conditions, spinal microcircuits undergo specific multiphasic homeostatic compensations to preserve force output.

Abstract Immune system molecules are expressed by neurons, often for unknown functions. We have identified IL-13 and its receptor IL-13Ra1 as neuronal, synaptic proteins in mouse, rat, and human brains, whose engagement upregulates the phosphorylation of NMDAR and AMPAR subunits and, in turn, increases synaptic activity and CREB-mediated transcription. We demonstrate that increased IL-13 is a hallmark of traumatic brain injury (TBI) in mice as well as in two distinct cohorts of human patients. We also provide evidence that IL-13 upregulation protects neurons from excitotoxic death. We show IL-13 upregulation occurring in several cohorts of human brain samples and in CSF. Thus, IL-13 is a previously unrecognized physiological modulator of synaptic physiology of neuronal origin, with implications for the establishment of synaptic plasticity and the survival of neurons under injury conditions. Furthermore, we suggest that the neuroprotection afforded through the upregulation of IL-13 represents a new entry point for interventions in the pathophysiology of TBI.

Abstract Immunohistochemistry on archival human brains is often limited because several conditions arise that complicate the use for high-resolution fluorescence microscopy. In this study, we developed a novel clearing approach for immunofluorescence-based analysis of perfusion- and immersion-fixed post mortem human brain tissue, termed hCLARITY. hCLARITY is optimized for specificity by reducing off-target labeling and yields very sensitive stainings in human brain sections allowing for super-resolution microscopy with unprecedented imaging of pre- and postsynaptic compartments. Moreover, hallmarks of the Alzheimer’s disease were preserved with hCLARITY, and importantly classical DAB or Nissl stainings are compatible with this protocol. hCLARITY is extremely versatile as demonstrated by the use of more than 30 well performing antibodies and allows for de- and subsequent re-staining of the same tissue section, which is important for multi-labelling approaches, e.g., in super-resolution microscopy. Taken together, hCLARITY enables research of the human brain with highest sensitivity and down to sub-diffraction resolution and therefore has enormous potential for the investigation of local morphological changes, e.g., in neurodegenerative diseases. Striking Image / Graphical abstract Summary of the main advantages of hCLARITY. CLARITY was applied on human post mortem brain tissue in direct comparison to untreated sections (minus CLARITY). Owing to removal of lipids during the clearing with SDS and the resulting reduction in light scattering, cleared sections were less opaque. The denaturing effect of the detergent SDS most likely results in better accessibility of certain epitopes. The major benefits of hCLARITY were found in an increased sensitivity and specificity of antibodies for neuronal cells. The adapted hCLARITY protocol is compatible with staining techniques for confocal microscopy, super-resolution microscopy, and light microscopy.

Abstract Increased catabolism is a new clinical manifestation of Amyotrophic Lateral Sclerosis. A dysfunction of lateral hypothalamus may drive hypermetabolism in ALS; however, Its causes and anatomical substrates are unknown. We hypothesize that disruption cortico-hypothalamic circuits may impair energy homeostasis in ALS. We used rAAV2 for large-scale projection mapping and image analysis pipeline based on Wholebrain and Ilastik to quantify projections from the forebrain to the latera hypothalamus of the SOD1(G93A) ALS mouse model as well as of the Fus ΔNLS ALS mouse model. Expanded projections from agranular Insula, ventrolateral orbitofrontal and secondary motor cortex to lateral hypothalamus were found in two independent cohorts of the hypermetabolic SOD1(G93A) ALS model. The non-hypermetabolic Fus ΔNLS ALS mouse model display a loss of projections from motor cortex but no change in projections from insula and orbitofronal cortex. 3T DTI-MRI data on 83 ALS patients and 65 controls confirmed the disruption of the orbitofrontal-hypothalamic tract in ALS patients. Converging murine and human data demonstrate the selective disruption of hypothalamic inputs in ALS as a factor contributing to the origin of hypermetabolism. Significance statement We provide a circuit perspective of the recently identified and medically relevant hyper-metabolic phenotype of Amyotrophic Lateral Sclerosis. We demonstrate the selective involvement of orbitofrontal, insular and motor cortex projections to hypothalamus in murine ALS models and in human patients. The enhanced pipeline for large-scale registration, segmentation projections mapping, the identification of new circuits target of neurodegeneration, and the relevance of these circuits in metabolic disturbances make this work relevant not only for the investigation of ALS but also for other neurodegenerative disease as well as for all conditions characterized by systemic energy imbalances.

Altered neuronal excitability and synaptic inputs to motoneurons are part of the pathophysiology of Amyotrophic Lateral Sclerosis. The cAMP/PKA pathway regulates both of them but therapeutic interventions at this level are limited by the lack of knowledge about suitable pharmacological entry points. Here we used transcriptomics on microdissected and

Background Biomarkers of neuronal, glial cells and inflammation in traumatic brain injury (TBI) are available but they do not specifically reflect the damage to synapses, which represent the bulk volume of the brain. Experimental models have demonstrated extensive involvement of synapses in acute TBI, but biomarkers of synaptic damage in human patients have not been explored. Methods Single-molecule array assays were used to measure synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) and visinin-like protein 1 (VILIP-1) (along with neurofilament light chain (NFL), ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1), glial fibrillar acidic protein (GFAP), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8)) in ventricular cerebrospinal fluid (CSF) samples longitudinally acquired during the intensive care unit (ICU) stay of 42 patients with severe TBI or 22 uninjured controls. Results CSF levels of SNAP-25 and VILIP-1 are strongly elevated early after severe TBI and decline in the first few days. SNAP-25 and VILIP-1 correlate with inflammatory markers at two distinct timepoints (around D1 and then again at D5) in follow-up. SNAP-25 and VILIP-1 on the day-of-injury have better sensitivity and specificity for unfavourable outcome at 6 months than NFL, UCH-L1 or GFAP. Later elevation of SNAP-25 was associated with poorer outcome. Conclusion Synaptic damage markers are acutely elevated in severe TBI and predict long-term outcomes, as well as, or better than, markers of neuroaxonal injury. Synaptic damage correlates with initial injury and with a later phase of secondary inflammatory injury.

Abstract Background Traumatic Brain Injury (TBI) is characterized by massive changes in neuronal excitation, from acute excitotoxicity to chronic hyper- or hypoexcitability. Nuclear calcium signaling pathways are involved in translating changes in synaptic inputs and neuronal activity into discrete transcriptional programs which not only affect neuronal survival and synaptic integrity, but also the crosstalk between neurons and glial cells. Here we report the effects of blunting neuronal nuclear calcium signals in the context of TBI. Methods We used AAV vectors to express the genetically-encoded and nuclear-targeted calcium buffer parvalbumin (PV.NLS.mCherry) or the calcium/calmodulin buffer CaMBP4.mCherry in neurons only. Upon TBI, the extent of neuroinflammation, neuronal death and synaptic loss were assessed by immunohistochemistry and targeted transcriptome analysis. Modulation of the overall level of neuronal activity was achieved by PSAM/PSEM chemogenetics targeted to parvalbumin interneurons. The functional impact of neuronal nuclear Calcium buffering in TBI was assessed by quantification of spontaneous whisking. Results Buffering neuronal nuclear calcium unexpectedly resulted in a massive and long-lasting increase in the recruitment of reactive microglia to the injury site, which was characterised by a disease-associated and phagocytic phenotypes. This effect was accompanied by a substantial surge in synaptic loss and significantly reduced whisking activity. Transcriptome analysis revealed a complex effect of TBI in the context of neuronal nuclear calcium buffering, with upregulation of complement factors, chemokines and interferon-response genes, as well as the downregulation of synaptic genes and epigenetic regulators compared to control conditions. Notably, nuclear calcium buffering led to a substantial loss in neuronal osteoprotegerin (OPG). Whereas stimulation of neuronal firing induced OPG expression. Viral re-expression of OPG resulted in decreased microglial recruitment and synaptic loss. OPG upregulation was also observed in the CSF of human TBI patients, underscoring its translational value. Conclusion Neuronal nuclear calcium signals regulate the degree of microglial recruitment and reactivity upon TBI via, among others, osteoprotegerin signals. Our findings support a model whereby neuronal activity altered after TBI exerts a powerful impact on the neuroinflammatory cascade, which in turn contributes to the overall loss of synapses and functional impairment.

Abstract Patients suffering from Autism Spectrum Disorders (ASD) experience disturbed nociception in form of either hyposensitivity to pain or hypersensitivity and allodynia. We have determined that Shank2-KO mice, which recapitulate the genetic and behavioural disturbances of ASD, display increased sensitivity to formalin pain and thermal, but not mechanical allodynia. We demonstrate that high levels of Shank2 expression identifies a subpopulation of neurons in murine and human dorsal spinal cord, composed mainly by glycinergic interneurons and that loss of Shank2 causes the decrease in NMDAR in excitatory synapses on these inhibitory interneurons. In fact, in the subacute phase of the formalin test, glycinergic interneurons are strongly activated in WT mice but not in Shank2-KO mice. As consequence, nociception projection neurons in lamina I are activated in larger numbers in Shank2-KO mice. Our findings prove that Shank2 expression identifies a new subset of inhibitory interneurons involved in reducing the transmission of nociceptive stimuli and whose unchecked activation is associated with pain hypersensitivity. Thus, we provide evidence that dysfunction of spinal cord pain processing circuits may underlie the nociceptive phenotypes in ASD patients and mouse models.

Abstract Blood-based biomarkers have proven to be a reliable measure of traumatic brain injury (TBI) severity and outcome, in both murine models and patients. In particular, neuron-specific enolase (NSE) and neurofilament light (NFL) have been investigated in the clinical setting post injury. Ethanol intoxication (EI) remains a significant comorbidity in TBI, with 30-40% of patients having a positive blood alcohol level (BAC) post TBI. The effect of ethanol on blood-based biomarkers on the prognosis and diagnosis of TBI remain unclear. In this study, we investigated the effect of EI on NSE and NFL and their correlation with blood-brain barrier (BBB) integrity in a murine model of TBI. We have used ultra-sensitive single molecule array technology (SIMOA) and ELISA methods to measure NFL, NSE and Claudin-5 concentrations in plasma 3h post TBI. We showed that both NFL and NSE were increased 3h post TBI. However, ethanol blood concentrations only showed an inverse correlation with NSE, but not NFL. Claudin-5 levels were increased post injury, but no difference was detected in EI. The Claudin-5 increase post TBI was correlated with NFL, but not with NSE. Thus, the data indicate that ethanol has a confined effect on biomarker release in the bloodstream and neuronal biomarkers reflect a different pathophysiology upon TBI.