Abstract The Immunological Proteome Resource (ImmPRes ; http://immpres.co.uk/ ) is an open access public resource integrating proteomic data generated by large-scale mass-spectrometry analysis of murine hematopoietic populations. The initial focus is T lymphocytes and how their proteomes are shaped by immune activation, environment, and intracellular signalling pathways with an aim to expand it to B cells and innate immune cells. It is a multidisciplinary effort between immunology and mass spectrometry-based labs with the objective to help define an in-depth high-quality map of immune cell proteomes. Maintaining data reproducibility and integrity are a priority within the resource, thus there is an in-depth protocols section explaining in detail the sample processing and the mass spectrometry-based analysis. ImmPRes provides open access to proteomic datasets covering a wide range of murine leukocyte populations with analysis of copy numbers per cell of > 10,000 proteins, enabling new understanding of lymphocyte phenotypes. All data is accessible via a simple graphical interface that supports easy interrogation of the data and options to download data summaries and raw data files.

Abstract Integration of a large network of kinase signalling pathways co-ordinates changes in the transcription, translation and metabolic events required for T cell activation and differentiation. The present study explores the role of the Serine/Threonine kinases PIM1 and PIM2 in controlling murine CD8 T lymphocyte antigen receptor-mediated activation and differentiation in response to the cytokines Interleukin 2 (IL-2) or IL-15. We show that PIM kinases are dispensable for the differentiation programs controlled by the antigen-receptor and IL-15. There is however a selective role for the PIM kinases in the context of IL-2 regulation of CD8 T cell fate. One key insight was that the PIM kinases controlled the migratory capabilities of effector CD8 T cells, with Pim1 / Pim2 -deficient CD8 T cells unable to fully switch off the naïve T cell chemokine and adhesion receptor program during effector differentiation. PIM kinases were also needed for IL-2 to sustain high expression of the glucose transporters SLC2A1 and SLC2A3 and to maintain activity of the nutrient sensing kinase mTORc1. Strikingly, PIM kinases did not have a dominant impact on IL-2-driven transcriptional programs but rather selectively modulated protein synthesis to shape cytotoxic T cell proteomes. This study reveals a selective role of PIM kinases in IL-2 control of CD8 T cells and highlights how regulated changes in protein synthesis can impact T cell phenotypes.

Immune activated T lymphocytes modulate the activity of key metabolic pathways to support the transcriptional reprograming and reshaping of cell proteomes that permits effector T cell differentiation. The present study uses high resolution mass spectrometry and metabolic labelling to explore how T cells control the methionine cycle to produce methyl donors for protein and nucleotide methylations. We show that antigen receptor engagement controls flux through the methionine cycle and also controls RNA and histone methylations. We establish that the main rate limiting step for the methionine cycle is control of methionine transporter expression by antigen receptors. Only T cells that respond to antigen to upregulate and sustain methionine transport are supplied with the methyl donors that permit the dynamic nucleotide methylations and epigenetic reprogramming that drives T cell differentiation.

Summary The integration of multiple signalling pathways that co-ordinate T cell metabolism and transcriptional reprogramming is required to drive T cell differentiation and proliferation. One key T cell signalling module is mediated by extracellular signal-regulated kinases (ERKs) which are activated in response to antigen receptor engagement. The activity of ERKs is often used to report antigen receptor occupancy but the full details of how ERKs control T cell activation is not understood. Accordingly, we have used mass spectrometry to explore how ERK signalling pathways control antigen receptor driven proteome restructuring in CD8 + T cells to gain insights about the biological processes controlled by ERKs in primary lymphocytes. Quantitative analysis of >8000 proteins identified only 900 ERK regulated proteins in activated CD8 + T cells. The data identify both positive and negative regulatory roles for ERKs during T cell activation and reveal that ERK signalling primarily controls the repertoire of transcription factors, cytokines and cytokine receptors expressed by activated T cells. The ERKs thus drive the transcriptional reprogramming of activated T cells and the ability of T cells to communicate with external immune cues.

Abstract Autophagy is important for CD8 T-cells but autophagy timing, triggers and targets are poorly defined. Herein, we show naïve CD8-T cells have high autophagic flux and identify an autophagy checkpoint whereby antigen receptor engagement represses autophagy by regulating amino acid transporter expression and intracellular amino acid delivery. Effector cytotoxic T cells with high levels of amino acid transporters driven by proinflammatory cytokines have low autophagic flux but rapidly reinduce autophagy when amino acid restricted. A census of proteins degraded and fuelled by autophagy shows how autophagy shapes CD8-T cell proteomes. In cytotoxic T-cells, dominant autophagy substrates include cytolytic effector molecules, amino acid and glucose transporters. In naïve T-cells mitophagy dominates and selective mitochondrial pruning supports the expression of molecules that coordinate T-cell migration and survival. Autophagy thus differentially prunes naive and effector T-cell proteomes and is dynamically repressed by antigen receptors and inflammatory cytokines to shape T-cell differentiation.

Abstract Tissue-resident intestinal intraepithelial T lymphocytes (T-IEL) patrol the gut and have important roles in regulating intestinal homeostasis. T-IEL include both induced T-IEL, derived from systemic antigen-experienced lymphocytes, and natural IEL, which are developmentally targeted to the intestine. While the processes driving T-IEL development have been elucidated, the precise roles of the different subsets and the processes driving activation and regulation of these cells remain unclear. To gain functional insights into these enigmatic cells, we used high-resolution, quantitative mass spectrometry to investigate the proteomic landscape of the main T-IEL populations in the gut. Comparing the proteomes of induced T-IEL and natural T-IEL subsets, with naive CD8 + T cells from lymph nodes exposes the dominant effect of the gut environment over ontogeny on T-IEL phenotypes. Analyses of protein copy numbers of >7000 proteins in T-IEL reveal skewing of the cell surface repertoire towards epithelial interactions and checkpoint receptors; strong suppression of the metabolic machinery indicating a high energy barrier to functional activation; and changes in T cell antigen receptor signalling pathways reminiscent of chronically activated T cells. These novel findings illustrate how multiple input signals need to be integrated to regulate T-IEL function.