Abstract m 6 A, one of the most abundant mRNA modifications, has been associated with various metabolic processes in plants. Here we show that m 6 A also plays a role in miRNA biogenesis in Arabidopsis thaliana. Significant reductions in plant m 6 A/MTA levels results in lower accumulation of miRNAs whereas pri-miRNA levels tend to be higher in such plants. m 6 A-IP Seq and MTA-GFP RIP were used to show that many pri-miRNAs are m 6 A methylated and are bound by MTA, further demonstrating that pri-miRNAs can also be substrates for m 6 A methylation by MTA. We report that MTA interacts with RNA Pol II, supporting the assumption that m 6 A methylation is a co-transcriptional process, and also identify TGH, a known miRNA biogenesis related protein, as a novel protein that interacts with MTA. Finally, reduced levels of miR393b may partially explain the strong auxin insensitivity seen in Arabidopsis plants with reduced m 6 A levels.

Abstract Background Accurate and comprehensive annotation of transcript sequences is essential for transcript quantification and differential gene and transcript expression analysis. Single molecule long read sequencing technologies provide improved integrity of transcript structures including alternative splicing, and transcription start and polyadenylation sites. However, accuracy is significantly affected by sequencing errors, mRNA degradation or incomplete cDNA synthesis. Results We present a new and comprehensive Arabidopsis thaliana Reference Transcript Dataset 3 (AtRTD3). AtRTD3 contains over 160k transcripts - twice that of the best current Arabidopsis transcriptome and including over 1,500 novel genes. 79% of transcripts are from Iso-seq with accurately defined splice junctions and transcription start and end sites. We developed novel methods to determine splice junctions and transcription start and end sites accurately. Mis- match profiles around splice junctions provided a powerful feature to distinguish correct splice junctions and remove false splice junctions. Stratified approaches identified high confidence transcription start/end sites and removed fragmentary transcripts due to degradation. AtRTD3 is a major improvement over existing transcriptomes as demonstrated by analysis of an Arabidopsis cold response RNA-seq time-series. AtRTD3 provided higher resolution of transcript expression profiling and identified cold- and light-induced differential transcription start and polyadenylation site usage. Conclusions AtRTD3 is the most comprehensive Arabidopsis transcriptome currently available. It improves the precision of differential gene and transcript expression, differential alternative splicing, and transcription start/end site usage from RNA-seq data. The novel methods for identifying accurate splice junctions and transcription start/end sites are widely applicable and will improve single molecule sequencing analysis from any species.

Abstract Aims Drought is a climate threat limiting crop production. Potato is one of the four most important food crops worldwide and is sensitive to water shortage. The CBP80 gene was shown to affect plant response to drought by regulating the level of microRNA159, and, consequently, the levels of the MYB33 and MYB101 transcription factors. (TF) Our studies aimed to show whether indeed the level of MYB33, MYB65, and MYB101 TFs affects plant response to water shortage. Methods Arabidopsis transgenic plants exhibiting downregulation and Arabidopsis and potato transgenic plants exhibiting overexpression of selected MYB TFs were obtained. Plants response to drought was mainly measured using relative water content (RWC) and stomata closure upon exogenous ABA. Results Three MYB TFs studied are involved in plant response to drought. When downregulated in Arabidopsis, the MYB33, MYB65 and MYB101 genes cause stomatal hyposensitivity to ABA, leading to reduced tolerance to drought. Transgenic Arabidopsis and potato plants overexpressing a mutated version of these genes with changed miR159 recognition site, show hypersensitivity to ABA and relatively high tolerance to drought conditions. Conclusions The MYB33, MYB65, and MYB101 genes are good be potential targets for innovative breeding to obtain crops with relatively high tolerance to drought.

Abstract Cotranscriptional processing of RNA polymerase II-generated primary transcripts is a well-documented phenomenon. We recently showed that in plants, miRNA biogenesis is also a cotranscriptional event. Here, we report that Arabidopsis PRP40, the U1 snRNP auxiliary protein, positively regulates the recruitment of SE, the core component of the plant microprocessor, to miRNA genes. The association of DCL1, the microprocessor endoribonuclease, with chromatin was altered in prp40ab mutant plants. Impaired cotranscriptional microprocessor assembly was accompanied by RNA polymerase II accumulation at miRNA genes and retention of miRNA precursors at their transcription sites in the prp40ab mutant plants. We show that cotranscriptional microprocessor assembly, regulated by AtPRP40, positively affects RNAPII transcription of miRNA genes and is important to reach the correct levels of produced miRNAs.

Abstract DRB1 (HYL1) is a double-stranded RNA binding protein involved in miRNA processing in plants. It is a core component of the Microprocessor complex and enhances the efficiency and precision of miRNA processing by DCL1 protein. In this work, we report a novel function of DRB1 protein in the transcription of MIR genes. DRB1 co-localizes with RNA Polymerase II and affects its distribution along MIR genes. Moreover, proteomic experiments revealed that DRB1 protein interacts with many transcription factors. Finally, we show that the action of DRB1 is not limited to MIR genes as it impacts expression of many other genes, majority of which are involved in plant response to light. These discoveries add DRB1 as another player of gene regulation at transcriptional level, independent of its role in miRNA biogenesis.

Summary In most organisms, the maturation of nascent RNAs is coupled to transcription, undergoing many processing steps co-transcriptionally. Unlike in animals, the RNA polymerase II (RNAPII) transcribes microRNAs (miRNAs) as long and structurally variable pri-miRNAs in plants. Current evidence suggests that the miRNA biogenesis complex assembly initiates early during the transcription of pri-miRNAs in plants. However, it is unknown whether miRNA processing occurs co-transcriptionally. Here, we show that plant miRNA biogenesis is coupled to transcription in a process that relies on the formation of DNA:RNA hybrids (R-loops) between the nascent transcript and the encoding loci. We used native elongating transcript sequencing data and imaging techniques to demonstrate that plant miRNA biogenesis occurs co-transcriptionally. We found that the entire biogenesis occurs coupled to transcription for pri-miRNAs processed from the loop but requires a second nucleoplasmic step for those processed from the base of the hairpin. Furthermore, we found that co- and post-transcriptional miRNA processing mechanisms co-exist for most miRNAs in a dynamic balance. Notably, we discovered that R-loops between the 5’-end single-stranded arm of the pri-miRNAs and the encoding loci anchor the transcript, promoting co-transcriptional processing. Our data demonstrate the coupling of transcription and miRNA processing in plants and discovered an unexpected function for R-loops promoting RNA processing. Furthermore, our results suggest the neo-functionalization of co-transcriptionally processed miRNAs, boosting countless regulatory scenarios.

Abstract SmD3 is a core component of the small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) that is essential for pre-mRNA splicing. The role of Arabidopsis SmD3 in plant immunity was assessed by testing sensitivity of smd3a and smd3b mutants to Pseudomonas syringae pv. tomato ( Pst ) DC3000 infection and its pathogenesis effectors flagellin (flg22), EF-Tu (elf18) and coronatine (COR). Both smd3 mutants exhibited enhanced susceptibility to Pst accompanied by marked changes in the expression of key pathogenesis markers. mRNA levels of these factors were also altered upon treatment with Pseudomonas effectors. We showed that SmD3-b dysfunction impairs mainly stomatal immunity as a result of defects in stomatal development. Our genome-wide transcriptome analysis of the smd3b-1 mutant infected with Pst revealed that lack of SmD3-b deregulates defense against Pst infection at the transcriptional and posttranscriptional levels including defects in splicing and an altered pattern of alternative splicing. Other changes in the smd3b-1 mutant involved enhanced elf18- and flg22-induced callose deposition, reduction of flg22-triggered production of early ROS and boost of secondary ROS caused by Pst infection. Together, our data indicate that SmD3 contributes to the plant immune response possibly via regulation of mRNA splicing of key pathogenesis factors.

SERRATE/ARS2 is a conserved RNA effector protein involved in transcription, processing and export of different types of RNAs. In Arabidopsis, the best-studied function of SERRATE (SE) is to promote miRNA processing. Here, we report that SE interacts with the Nuclear Exosome Targeting (NEXT) complex, comprising the RNA helicase HEN2, the RNA binding protein RBM7 and one of the two zinc-knuckle proteins ZCCHC8A/ZCCHC8B. The identification of common targets of SE and HEN2 by RNA-seq supports the idea that SE cooperates with NEXT for RNA surveillance by the nuclear exosome. Among the RNA targets accumulating in absence of SE or NEXT are miRNA precursors. Loss of NEXT components results in the accumulation of pri-miRNAs without affecting levels of miRNAs, indicating that NEXT is, unlike SE, not required for miRNA processing. As compared to se-2, se-2 hen2-2 double mutants showed increased accumulation of pri-miRNAs, but partially restored levels of mature miRNAs and attenuated developmental defects. We propose that the slow degradation of pri-miRNAs caused by loss of HEN2 compensates for the poor miRNA processing efficiency in se-2 mutants, and that SE regulates miRNA biogenesis through its double contribution in promoting miRNA processing but also pri-miRNA degradation through the recruitment of the NEXT complex.### Competing Interest Statement

In light of recent studies, many of the cytoplasmic posttranscriptional mRNA processing steps take place in highly specialized microdomains referred to as cytoplasmic bodies. These evolutionarily conserved microdomains are sites of regulation for both mRNA translation and degradation. It has been shown that in the larch microsporocyte cytoplasm, there is a significant pool of Sm proteins not related to snRNP complexes. These Sm proteins accumulate within distinct cytoplasmic bodies (S-bodies) that also contain mRNA. Sm proteins constitute an evolutionarily ancient family of small RNA-binding proteins. In eukaryotic cells, these molecules are involved in pre-mRNA splicing. The latest research indicates that in addition to this well-known function, Sm proteins could also have an impact on mRNA at subsequent stages of its life cycle. The aim of this work was to verify the hypothesis that canonical Sm proteins are part of the cytoplasmic mRNP complex and thus function in the posttranscriptional regulation of gene expression in plants.

ABSTRACT Cleavage factor I (CFI) is a four-subunit protein complex of the pre-mRNA 3’ end processing machinery in eukaryotes. In Arabidopsis, AtCFI25a, AtCFI25b, AtCFI59, and AtCFI68 have been identified as potential components of AtCFI, in silico . Here, we show that the AtCFI25a, AtCFI59, and AtCFI68 proteins each pulled down all components of the CFI, confirming that these subunits form the plant CFI complex. Furthermore, either AtCFI59 or AtCFI68 was essential for nuclear localization of the smallest subunit, AtCFI25a. Mutants with single loss-of-function for AtCFI59 or AtCFI68 showed no obvious morphological defects compared to wild-type plants, while the double mutant displayed pleiotropic morphological defects, identical to those previously reported for AtCFI25a loss-of-function plants. Moreover, these morphological defects correlated with alterations in the usage of 3’ UTR cleavage and polyadenylation sites. atcfi25a , atcfi25a atcfi25b and atcfi59 atcfi68 double mutants showed widespread changes in the choice of cleavage and polyadenylation sites. In most cases, more proximal cleavage and polyadenylation sites were used, leading to shorter 3’ UTRs. In particular, genes involved in light intensity, light harvesting, photosynthesis and cold responses showed significant dependence on AtCFI function. Furthermore, transcripts coding for AtCFI subunits showed altered 3’ end processing in these mutants, suggesting self-regulation function of AtCFI in plants.