Summary The family Methanoperedenaceae archaea mediate anaerobic oxidation of methane (AOM) in various terrestrial environments. In this study, we newly developed a high-pressure laboratory incubation system by controlling hydraulic pressure ranging from ambient to 5 MPa. Using the system, we investigated groundwater from 214- and 249-m deep boreholes at Horonobe Underground Research Laboratory, Japan, where the high and low abundances of Methanoperedenaceae archaea have been revealed by genome-resolved metagenomics, respectively. We incubated the groundwater samples amended with or without amorphous Fe(III) as an electron acceptor and 13 C-labelled methane at an in-situ pressure of 1.6 MPa. After three to seven-day incubation, AOM activities were not detected from the 249-m deep groundwater but from the 214-m deep groundwater. The AOM rates were 93.7 ± 40.6 and 27.7 ± 37.5 nM/day with and without Fe(III) amendment. To clarify the differences in AOM activity between the 214- and 249-m deep groundwater samples, we characterized Fe(III) contents in suspended particulates collected by filtration. The particulates were not visible in the 249-m deep groundwater on the filter, while they were abundant and contained Fe(III)-bearing phyllosilicates in the 214-m deep groundwater. These results support the in-situ activity of Fe(III)-dependent AOM in the deep subsurface borehole.

Underground research laboratories (URLs) provide a window on the deep biosphere and enable investigation of potential microbial impacts on nuclear waste, CO2 and H2 stored in the subsurface. We carried out the first multi-year study of groundwater microbiomes sampled from defined intervals between 140 and 400 m below the surface of the Horonobe and Mizunami URLs, Japan. We reconstructed draft genomes for >90% of all organisms detected over a four year period. The Horonobe and Mizunami microbiomes are dissimilar, likely because the Mizunami URL is hosted in granitic rock and the Horonobe URL in sedimentary rock. Despite this, hydrogen metabolism, rubisco-based CO2 fixation, reduction of nitrogen compounds and sulfate reduction are well represented functions in microbiomes from both URLs, although methane metabolism is more prevalent at the organic- and CO2-rich Horonobe URL. High fluid flow zones and proximity to subsurface tunnels select for candidate phyla radiation bacteria in the Mizunami URL. We detected near-identical genotypes for approximately one third of all genomically defined organisms at multiple depths within the Horonobe URL. This cannot be explained by inactivity, as in situ growth was detected for some bacteria, albeit at slow rates. Given the current low hydraulic conductivity and groundwater compositional heterogeneity, ongoing inter-site strain dispersal seems unlikely. Alternatively, the Horonobe URL microbiome homogeneity may be explained by higher groundwater mobility during the last glacial period. Genotypically-defined species closely related to those detected in the URLs were identified in three other subsurface environments in the USA. Thus, dispersal rates between widely separated underground sites may be fast enough relative to mutation rates to have precluded substantial divergence in species composition. Species overlaps between subsurface locations on different continents constrain expectations regarding the scale of global subsurface biodiversity. Overall, microbiome and geochemical stability over the study period has important implications for underground storage applications.