Despite recent advances in crystallography and the availability of G-protein-coupled receptor (GPCR) structures, little is known about the mechanism of their activation process, as only the β2 adrenergic receptor (β2AR) and rhodopsin have been crystallized in fully active conformations. Here we report the structure of an agonist-bound, active state of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor stabilized by a G-protein mimetic camelid antibody fragment isolated by conformational selection using yeast surface display. In addition to the expected changes in the intracellular surface, the structure reveals larger conformational changes in the extracellular region and orthosteric binding site than observed in the active states of the β2AR and rhodopsin. We also report the structure of the M2 receptor simultaneously bound to the orthosteric agonist iperoxo and the positive allosteric modulator LY2119620. This structure reveals that LY2119620 recognizes a largely pre-formed binding site in the extracellular vestibule of the iperoxo-bound receptor, inducing a slight contraction of this outer binding pocket. These structures offer important insights into the activation mechanism and allosteric modulation of muscarinic receptors. Very little is known about how a G-protein-coupled receptor (GPCR) transitions from an inactive to an active state, but this study has solved the X-ray crystal structures of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to a high-affinity agonist in an active state and to a high-affinity agonist and a small-molecule allosteric modulator in an active state; the structures provide insights into the activation mechanism and allosteric modulation of muscarinic receptors. The structures of many G-protein-coupled receptors (GPCRs), including members of the class B and class F families, are now available but little is known about the transitions from the inactive to active states. In this study the authors solve the X-ray crystal structures of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor in the active state bound to the agonist iperoxo alone and in combination with LY2119620, a positive allosteric modulator. The structures reveal that the activated M2 receptor has an extremely small orthosteric binding site, with LY2119620 'sitting' right on top of the agonist. The authors also note that the region that makes up the allosteric site in the inactive conformation of the M2 receptor is too large to bind to LY2119620; this means that the extracellular region needs to contract (by binding to the high-affinity agonist) before LY2119620 can bind to the allosteric site. This GPCR is essential for the physiological control of cardiovascular function, cognition, and pain perception, and since allosteric sites are less conserved in sequence and structure than the orthosteric binding site, the hope is that ligands that bind to allosteric sites could be turned into drugs that selectively interact with only one of the five muscarinic receptor subtypes.

Morphine is an alkaloid from the opium poppy used to treat pain. The potentially lethal side effects of morphine and related opioids—which include fatal respiratory depression—are thought to be mediated by μ-opioid-receptor (μOR) signalling through the β-arrestin pathway or by actions at other receptors. Conversely, G-protein μOR signalling is thought to confer analgesia. Here we computationally dock over 3 million molecules against the μOR structure and identify new scaffolds unrelated to known opioids. Structure-based optimization yields PZM21—a potent Gi activator with exceptional selectivity for μOR and minimal β-arrestin-2 recruitment. Unlike morphine, PZM21 is more efficacious for the affective component of analgesia versus the reflexive component and is devoid of both respiratory depression and morphine-like reinforcing activity in mice at equi-analgesic doses. PZM21 thus serves as both a probe to disentangle μOR signalling and a therapeutic lead that is devoid of many of the side effects of current opioids. Computational docking to the the μ-opioid-receptor identifies PZM21, a novel selective biased agonist that generates substantial affective analgesia in mice without altering respiration or inducing drug reinforcement. Morphine and other alkaloids from the opium poppy are μ-opioid receptor agonists that have been used to treat pain for many centuries. These authors used a computational approach to dock over three million small molecules to the μ-opioid receptor. Structure-based optimization of the most promising structures led to the identification of a potent agonist, PZM21, with exceptional subtype selectivity for the μ-opioid receptor. In mice, PZM21 generates substantial analgesia, which is fully ablated in μ-opioid receptor knockout animals. This small molecule seems to reduce the affective component of pain, without detectably altering reflexive behaviours, and has little effect on respiration.

Abstract Allosteric modulators provide therapeutic advantages over orthosteric drugs. A plethora of allosteric modulators have been identified for several GPCRs, particularly for muscarinic receptors (mAChRs) 1,2 . To study the molecular mechanisms governing allosteric modulation, we utilized a recently developed NMR system to investigate the conformational changes in the M2 muscarinic receptor (M2R) in response to the positive allosteric modulator (PAM) LY2119620. Our studies provide the first biophysical data showing that LY2119620 can substantially change the structure and dynamics of M2R in both the extracellular and G-protein coupling domains during the activation process. These NMR data suggest that LY2119620 may function by stabilizing distinct sets of conformations not observed in the presence of orthosteric agonists alone, which may account for the different signaling behaviors of the M2R when bound to LY2119620. Our studies provide new structural information for understanding the mechanism of GPCR allostery, and may facilitate the rational design of allosteric therapeutics targeting muscarinic receptors.

Molecular imaging using positron emission tomography (PET) can serve as a promising tool for visualizing biological targets in the brain. Insights into the expression pattern and the in vivo imaging of the G protein-coupled orexin receptors OX1R and OX2R will further our understanding of the orexin system and its role in various physiological and pathophysiological processes. Guided by crystal structures of our lead compound JH112 and the approved hypnotic drug suvorexant bound to OX1R and OX2R, respectively, we herein describe the design and synthesis of two novel radioligands, [18F]KD23 and [18F]KD10. Key to the success of our structural modifications was a bioisosteric replacement of the triazole moiety with a fluorophenyl group. The 19F-substituted analog KD23 showed high affinity for the OX1R and selectivity over OX2R, while the high affinity ligand KD10 displayed similar Ki values for both subtypes. Radiolabeling starting from the respective pinacol ester precursors resulted in excellent radiochemical yields of 93% and 88% for [18F]KD23 and [18F]KD10, respectively, within 20 min. The new compounds will be useful in PET studies aimed at subtype-selective imaging of orexin receptors in brain tissue.

G protein coupled receptors (GPCRs) exhibit varying degrees of selectivity for different G protein isoforms. Despite the abundant structures of GPCR-G protein complexes, little is known about the mechanism of G protein coupling specificity. The β2-adrenergic receptor is an example of GPCR with high selectivity for Gαs, the stimulatory G protein for adenylyl cyclase, and much weaker for the Gαi family of G proteins inhibiting adenylyl cyclase. By developing a new Gαi-biased agonist (LM189), we provide structural and biophysical evidence supporting that distinct conformations at ICL2 and TM6 are required for coupling of the different G protein subtypes Gαs and Gαi. These results deepen our understanding of G protein specificity and bias and can accelerate the design of ligands that select for preferred signaling pathways.

Abstract Bitter taste receptors (TAS2Rs), a subfamily of G-protein coupled receptors (GPCRs) expressed orally and extraorally, elicit signaling in response to a large set of ligands. Among the 25 functional TAS2Rs encoded in the human genome, TAS2R14 is the most promiscuous, and responds to hundreds of chemically diverse agonists. Here, we present the cryo–electron microscopy (cryo-EM) structure of the human TAS2R14 (hTAS2R14) in complex with its cognate signaling partner gustducin, and bound to flufenamic acid (FFA), a clinically approved nonsteroidal anti-inflammatory drug. The structure reveals an unusual binding mode for FFA, where two copies are bound at distinct binding pockets: one at the canonical GPCR site within the trans-membrane bundle, and the other in the intracellular facet, bridging the receptor with gustducin. Combined with site-directed mutagenesis and the design of a fluorescent FFA derivative for pocket-specific ligand binding BRET assays, our studies support a dual binding mode for FFA in TAS2R14. These results fill a gap in the understanding of bitter taste signaling and provide tools for guided design of TAS2R-targeted compounds.

Abstract The μ-opioid receptor (μOR) is the major target for opioid analgesics. Activation of μOR initiates signaling through G protein pathways as well as through β-arrestin recruitment. μOR agonists that are biased towards G protein signaling pathways demonstrate diminished side effects. PZM21, discovered by computational docking, is a G protein biased μOR agonist. Here we report the cryoEM structure of PZM21 bound μOR in complex with G i protein. Structure-based evolution led to multiple PZM21 analogs with more pronounced G i protein bias and increased lipophilicity to improve CNS penetration. Among them, FH210 shows extremely low potency and efficacy for arrestin recruitment. We further determined the cryoEM structure of FH210 bound to μOR in complex with G i protein and confirmed its expected binding pose. The structural and pharmacological studies reveal a potential mechanism to reduce β-arrestin recruitment by the μOR, and hold promise for developing next-generation analgesics with fewer adverse effects. Table of Contents Graphical Abstract We obtained cryoEM structures of the μ-opioid receptor (μOR) bound to the lead compound PZM21 and the newly developed agonist FH210 to understand the mechanism of their biased signaling and to guide the evolution of next-generation analgesics with fewer adverse effects.

The G protein-coupled serotonin receptor 5-HT1AR mediates antinociception and may serve as a valuable target for the treatment of pain. Starting from a chemical library, ST171, a bitopic chemotype activating 5 HT1AR was evolved. In vitro pharmacological investigations of ST171 revealed potent and selective Gi activation (EC50 = 0.3 nM), with marginal Gs and beta-arrestin recruitment. Preclinical studies in mice showed that ST171 was effective in acute and chronic (inflammatory and neuropathic) pain models, without causing sedation. Comparison of cryo-EM structures of a 5-HT1AR-Gi complex bound to the functionally biased agonist ST171, with a structure bound to the functionally balanced agonist befiradol, showed that both ligands bind to the same orthosteric site, but address different exo-sites. The individual poses are associated with ligand-specific helical dispositions and rearrangements of microdomains. Complementation of these studies with molecular dynamics simulations allowed us to derive structural features associated with the functional selectivity of ST171, a phenomenon that may be crucial to the discovery of more effective and safe GPCR drugs.

Abstract Background The orexin receptor (OXR) plays a role in drug addiction and is aberrantly expressed in colorectal tumors. Subtype-selective OXR PET ligands suitable for in vivo use have not yet been reported. This work reports the development of 18 F-labeled OXR PET ligand candidates derived from the OXR antagonist suvorexant and the OX1R-selective antagonist JH112. Results Computational analysis predicted that fluorine substitution (1e) and introduction of the fluorobenzothiazole scaffold (1f) would be suitable for maintaining high OX1R affinity. After multi-step synthesis of 1a–1f, in vitro OXR binding studies confirmed the molecular dynamics calculations and revealed single-digit nanomolar OX1R affinities for 1a–f, ranging from 0.69 to 2.5 nM. The benzothiazole 1f showed high OX1R affinity (K i = 0.69 nM), along with 77-fold subtype selectivity over OX2R. Cu-mediated 18 F-fluorination of boroxine precursors allowed for a shortened reaction time of 5 min to provide the non-selective OXR ligand [ 18 F]1c and its selective OX1R congener [ 18 F]1f in activity yields of 14% and 22%, respectively, within a total synthesis time of 52–76 min. [ 18 F]1c and [ 18 F]1f were stable in plasma and serum in vitro, with logD 7.4 of 2.28 ([ 18 F]1c) and 2.37 ([ 18 F]1f), and high plasma protein binding of 66% and 77%, respectively. Dynamic PET imaging in rats showed similar brain uptake of [ 18 F]1c (0.17%ID/g) and [ 18 F]1f (0.15%ID/g). However, preinjection of suvorexant did not significantly block [ 18 F]1c or [ 18 F]1f uptake in the rat brain. Pretreatment with cyclosporine A to study the role of P-glycoprotein (P-gp) in limiting brain accumulation moderately increased brain uptake of [ 18 F]1c and [ 18 F]1f. Accordingly, in vitro experiments demonstrated that the P-gp inhibitor zosuquidar only moderately inhibited polarized, basal to apical transport of 1c (p < 0.05) and had no effect on the transport of 1f, indicating that P-gp does not play a relevant role in brain accumulation of [ 18 F]1c and [ 18 F]1f in vivo. Conclusions The in vitro and in vivo results of [ 18 F]1c and [ 18 F]1f provide a solid basis for further development of suitable OXR PET ligands for brain imaging.