Regulation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity by kinases and phosphatases contributes to the modulation of synaptic transmission. Targeting of these enzymes near the substrate is proposed to enhance phosphorylation-dependent modulation. Yotiao, an NMDA receptor-associated protein, bound the type I protein phosphatase (PP1) and the adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP)-dependent protein kinase (PKA) holoenzyme. Anchored PP1 was active, limiting channel activity, whereas PKA activation overcame constitutive PP1 activity and conferred rapid enhancement of NMDA receptor currents. Hence, yotiao is a scaffold protein that physically attaches PP1 and PKA to NMDA receptors to regulate channel activity.

The type II cAMP-dependent protein kinase is localized to specific subcellular environments through the binding of the regulatory subunit (RII) dimer to RII-anchoring proteins. Computer-aided analysis of secondary structure, performed on four RII-anchoring protein sequences (the microtubule-associated protein 2, P150, and two thyroid proteins Ht 21 and Ht 31), has identified common regions of approximately 14 residues which display high probabilities of forming amphipathic helices. The potential amphipathic helix region of Ht 31 (Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile) lies between residues 494 and 507. A bacterially expressed 318-amino acid fragment, Ht 31 (418-736), containing the amphipathic helix region, was able to bind RII alpha. Site-directed mutagenesis designed to disrupt the secondary structure in the putative binding helix reduced binding dramatically. Specifically, substitution of proline for Ala-498 significantly diminished RII alpha binding, and similar mutation of Ile-502 or Ile-507 abolished interaction. Mutation of Ala-522 to proline, which is located outside the predicted amphipathic helix region, had no effect on RII alpha binding. These data suggest that anchoring proteins interact with RII alpha via an amphipathic helix binding motif.

RNAi is proving to be a powerful experimental tool for the functional annotation of mammalian genomes. The full potential of this technology will be realized through development of approaches permitting regulated manipulation of endogenous gene expression with coordinated reexpression of exogenous transgenes. We describe the development of a lentiviral vector platform, pSLIK (single lentivector for inducible knockdown), which permits tetracycline-regulated expression of microRNA-like short hairpin RNAs from a single viral infection of any naïve cell system. In mouse embryonic fibroblasts, the pSLIK platform was used to conditionally deplete the expression of the heterotrimeric G proteins Gα12 and Gα13 both singly and in combination, demonstrating the Gα13 dependence of serum response element-mediated transcription. In RAW264.7 macrophages, regulated knockdown of Gβ2 correlated with a reduced Ca 2+ response to C5a. Insertion of a GFP transgene upstream of the Gβ2 microRNA-like short hairpin RNA allowed concomitant reexpression of a heterologous mRNA during tetracycline-dependent target gene knockdown, significantly enhancing the experimental applicability of the pSLIK system.

Regulation of intracellular cyclic adenosine 3 ′,5 ′-monophosphate (cAMP) is integral in mediating cell growth, cell differentiation, and immune responses in hematopoietic cells. To facilitate studies of cAMP regulation we developed a BRET (bioluminescence resonance energy transfer) sensor for cAMP, CAMYEL (cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc), which can quantitatively and rapidly monitor intracellular concentrations of cAMP in vivo. This sensor was used to characterize three distinct pathways for modulation of cAMP synthesis stimulated by presumed Gs-dependent receptors for isoproterenol and prostaglandin E2. Whereas two ligands, uridine 5 ′-diphosphate and complement C5a, appear to use known mechanisms for augmentation of cAMP via Gq/calcium and Gi, the action of sphingosine 1-phosphate (S1P) is novel. In these cells, S1P, a biologically active lysophospholipid, greatly enhances increases in intracellular cAMP triggered by the ligands for Gs-coupled receptors while having only a minimal effect by itself. The enhancement of cAMP by S1P is resistant to pertussis toxin and independent of intracellular calcium. Studies with RNAi and chemical perturbations demonstrate that the effect of S1P is mediated by the S1P2 receptor and the heterotrimeric G13 protein. Thus in these macrophage cells, all four major classes of G proteins can regulate intracellular cAMP. Regulation of intracellular cyclic adenosine 3 ′,5 ′-monophosphate (cAMP) is integral in mediating cell growth, cell differentiation, and immune responses in hematopoietic cells. To facilitate studies of cAMP regulation we developed a BRET (bioluminescence resonance energy transfer) sensor for cAMP, CAMYEL (cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc), which can quantitatively and rapidly monitor intracellular concentrations of cAMP in vivo. This sensor was used to characterize three distinct pathways for modulation of cAMP synthesis stimulated by presumed Gs-dependent receptors for isoproterenol and prostaglandin E2. Whereas two ligands, uridine 5 ′-diphosphate and complement C5a, appear to use known mechanisms for augmentation of cAMP via Gq/calcium and Gi, the action of sphingosine 1-phosphate (S1P) is novel. In these cells, S1P, a biologically active lysophospholipid, greatly enhances increases in intracellular cAMP triggered by the ligands for Gs-coupled receptors while having only a minimal effect by itself. The enhancement of cAMP by S1P is resistant to pertussis toxin and independent of intracellular calcium. Studies with RNAi and chemical perturbations demonstrate that the effect of S1P is mediated by the S1P2 receptor and the heterotrimeric G13 protein. Thus in these macrophage cells, all four major classes of G proteins can regulate intracellular cAMP. Cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate (cAMP), a ubiquitous second messenger, mediates a wide range of cellular functions including cell metabolism (1Lania A. Mantovani G. Spada A. Eur. J. Endocrinol. 2001; 145: 543-559Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar), cell proliferation and differentiation (1Lania A. Mantovani G. Spada A. Eur. J. Endocrinol. 2001; 145: 543-559Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar), immune responses (2Castro A. Jerez M.J. Gil C. Martinez A. Med. Res. Rev. 2005; 25: 229-244Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar, 3Lerner A. Epstein P. Biochem. J. 2006; 393: 21-41Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar), memory formation (4Wang H. Storm D.R. Mol. Pharmacol. 2003; 63: 463-468Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar), and cardiac contractility (5Movsesian M.A. Bristow M.R. Curr. Top. Dev. Biol. 2005; 68: 25-48Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). Canonically, the concentration of intracellular cAMP is regulated by two distinct families of enzymes. The transmembrane adenylyl cyclases (ACs) 3The abbreviations used are: AC, adenylyl cyclase; ISO, isoproterenol; PGE, prostaglandin E2; C5a, complement C5a; S1P, sphingosine 1-phosphate; CAMYEL, cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc; EIA, enzyme-linked immunoassay; TER, terbutaline; BRET, bioluminescence resonance energy transfer; FRET, fluorescence resonance energy transfer; RL, Renilla luciferase; SERCA, sarcoplasmic reticulum calcium ATPase; ERK, extracellular signal-regulated kinase; PKA, cAMP-dependent protein kinase.3The abbreviations used are: AC, adenylyl cyclase; ISO, isoproterenol; PGE, prostaglandin E2; C5a, complement C5a; S1P, sphingosine 1-phosphate; CAMYEL, cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc; EIA, enzyme-linked immunoassay; TER, terbutaline; BRET, bioluminescence resonance energy transfer; FRET, fluorescence resonance energy transfer; RL, Renilla luciferase; SERCA, sarcoplasmic reticulum calcium ATPase; ERK, extracellular signal-regulated kinase; PKA, cAMP-dependent protein kinase. synthesize cAMP from adenosine triphosphate (6Beavo J.A. Brunton L.L. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3: 710-718Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar, 7Chin K-V. Yang W.-L. Ravatn R. Kita T. Reitman E. Vettori D. Cvijic M.E. Shin M. Iacono L. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002; 968: 49-64Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar), whereas the cAMP-specific phosphodiesterases metabolize cAMP to biologically inactive adenosine 5′-monophosphate (8Beavo J.A. Physiol. Rev. 1995; 75: 725-748Crossref PubMed Scopus (1634) Google Scholar, 9Houslay M.D. Milligan G. Trends Biochem. Sci. 1997; 22: 217-224Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar). ACs are primarily activated by Gαs but their activities can also be differentially regulated by Gαi, Gβγ, or Ca2+ (10Hanoune J. Defer N. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001; 41: 145-174Crossref PubMed Scopus (551) Google Scholar, 11Sunahara R.K. Taussig R. Mol. Interv. 2002; 2: 168-184Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar). The activities of various phosphodiesterases can be regulated by protein kinase A (PKA), extracellular-regulated kinase (ERK), phosphoinositide 3-kinase, and the concentration of cAMP itself (12Hoffmann R. Baillie G.S. MacKenzie S.J. Yarwood S.J. Houslay M.D. EMBO J. 1999; 18: 893-903Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar, 13MacKenzie S.J. Baillie G.S. McPhee I. Bolger G.B. Houslay M.D. J. Biol. Chem. 2000; 275: 16609-16617Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (200) Google Scholar, 14MacKenzie S.J. Baillie G.S. McPhee I. MacKenzie C. Seamons R. McSorley T. Millen J. Beard M.B. van Heeke G. Houslay M.D. Br. J. Pharmacol. 2002; 136: 421-433Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 15Sette C. Conti M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16526-16534Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 16Zhao A.Z. Huan J-N. Gupta S. Pal R. Sahu A. Nat. Neurosci. 2002; 5: 727-728Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar). Thus integration of signaling by stimuli that can regulate the intracellular concentration of cAMP will depend strongly on the various pathways and the subtypes of ACs and phosphodiesterases expressed in individual cells at any given time.Assessment of the regulation of intracellular cAMP in vivo has only become possible recently. Zaccolo et al. (17Zaccolo M. De Giorgi F. Cho C.Y. Feng L. Knapp T. Negulescu P.A. Taylor S.S. Tsien R.Y. Pozzan T. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 25-29Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar) first described a FRET sensor for cAMP based on the cAMP binding domain of PKA. Subsequently, several reports have described FRET sensors for cAMP based on binding of the nucleotide to the Epac proteins (18Bos J.L. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 733-738Crossref PubMed Scopus (412) Google Scholar, 19DiPilato L.M. Cheng X. Zhang J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 16513-16518Crossref PubMed Scopus (385) Google Scholar, 20Nikolaev V.O. Bunemann M. Hein L. Hannawacker A. Lohse M.J. J. Biol. Chem. 2004; 279: 37215-37218Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (582) Google Scholar, 21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). While these FRET sensors have been effective for measuring changes and localization of cAMP in single cells, measurements are tedious. Furthermore, the requirement for excitation of donor molecules produces a range of problems including cell damage, photobleaching, and low signal-to-noise ratios due to intrinsic cellular autofluorescence. This precludes use of the FRET sensors in high throughput population assays. In contrast, BRET (bioluminescence resonance energy transfer) sensors use an enzymatic reaction to produce energy emission in the donor, usually produce better signal-to-noise ratios, and are better suited for high throughput population assays (22Boute N. Jockers R. Issad T. Trends Pharmacol. Sci. 2002; 23: 351-354Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (218) Google Scholar). We report here the development and characterization of an Epac-based BRET sensor for cAMP (CAMYEL) with improved dynamic range and a method to quantify intracellular cAMP changes.This sensor was further used to characterize a novel phenomenon identified in RAW 264.7 cells. The Alliance for Cellular Signaling (AfCS) has conducted a comprehensive double ligand screen using the mouse macrophage-like cell line, RAW 264.7, to examine the extent of ligand interactions on a variety of downstream outputs, including cAMP (23Natarajan M. Lin K-M. Hsueh R.C. Sternweis P.C. Ranganathan R. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 571-580Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar). One of the striking results is the interaction between the lysophospholipid, sphingosine 1-phosphate (S1P), and ligands for receptors that stimulate cAMP. S1P alone does not significantly elevate either cAMP or Ca2+ in RAW 264.7 cells. However, S1P greatly increases the amount of intracellular cAMP stimulated by isoproterenol (ISO) and prostaglandin E2 (PGE). Other ligands that stimulate mobilization of Ca2+ in RAW 264.7 cells, such as complement C5a and uridine 5′-diphosphate (UDP), also enhance stimulation of cAMP by ISO and PGE, but are less efficacious than S1P.Receptors for S1P, formerly known as endothelial differentiation genes (Edg), are heptahelical transmembrane receptors that can variously interact with at least three G protein subfamilies, Gαi, Gαq, and Gα12/13 (25Pyne S. Pyne N. Biochem. J. 2000; 349: 385-402Crossref PubMed Scopus (659) Google Scholar, 26Rosen H. Goetzl E.J. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 560-570Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar, 27Siehler S. Manning D.R. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 94-99Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar), to affect regulation of phospholipase C (Gαi and Gαq), phosphoinositide 3-kinase (Gαi), and guanine nucleotide exchange factors for Rho (Gα12/13) (28An S. Zheng Y. Bleu T. J. Biol. Chem. 2000; 275: 288-296Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar, 29Ancellin N. Hla T. J. Biol. Chem. 1999; 274: 18997-19002Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (228) Google Scholar, 30Gonda K. Okamoto H. Takuwa N. Yatomi Y. Okazaki H. Sakurai T. Kimura S. Sillard R. Harii K. Takuwa Y. Biochem. J. 1999; 337: 67-75Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 31Kon J. Sato K. Watanabe T. Tomura H. Kuwabara A. Kimura T. Tamama K.-i. Ishizuka T. Murata N. Kanda T. Kobayashi I. Ohta H. Ui M. Okajima F. J. Biol. Chem. 1999; 274: 23940-23947Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (186) Google Scholar, 32Okamoto H. Takuwa N. Gonda K. Okazaki H. Chang K. Yatomi Y. Shigematsu H. Takuwa Y. J. Biol. Chem. 1998; 273: 27104-27110Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar, 33Windh R.T. Lee M-J. Hla T. An S. Barr A.J. Manning D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 27351-27358Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (279) Google Scholar). S1P has also been shown to regulate inhibition of intracellular cAMP by a receptor-dependent Gαi-mediated mechanism (29Ancellin N. Hla T. J. Biol. Chem. 1999; 274: 18997-19002Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (228) Google Scholar, 31Kon J. Sato K. Watanabe T. Tomura H. Kuwabara A. Kimura T. Tamama K.-i. Ishizuka T. Murata N. Kanda T. Kobayashi I. Ohta H. Ui M. Okajima F. J. Biol. Chem. 1999; 274: 23940-23947Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (186) Google Scholar, 32Okamoto H. Takuwa N. Gonda K. Okazaki H. Chang K. Yatomi Y. Shigematsu H. Takuwa Y. J. Biol. Chem. 1998; 273: 27104-27110Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar). Although S1P has been shown to stimulate intracellular cAMP in cells overexpressing S1P receptors, there is no evidence that the S1P receptors couple directly to Gαs and the mechanism remains unclear (30Gonda K. Okamoto H. Takuwa N. Yatomi Y. Okazaki H. Sakurai T. Kimura S. Sillard R. Harii K. Takuwa Y. Biochem. J. 1999; 337: 67-75Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar).Using the CAMYEL sensor, we identified roles for S1P2 receptors and G13 proteins in mediating the synergistic effect of S1P on cAMP responses. This is the first evidence that a G13 pathway is involved in the regulation of cAMP. Kinetic experiments indicate that the effect of S1P has rapid onset and works through increasing the rate of synthesis of the cyclic nucleotide.EXPERIMENTAL PROCEDURESReagents—Isoproterenol, prostaglandin E2, complement C5a, uridine 5′-diphosphate, 8-bromo cAMP, and phosphodiesterase inhibitors (Sigma), sphingosine 1-phosphate (Avanti Polar Lipids), terbutaline (Sigma), ICI 118551 (Biomol Research), SEW2871 (Cayman Chemical), and JTE 013 (Tocris bioscience) were purchased from the sources indicated.DNA Constructs—Epac1 (amino acids 148-881) was generated by RT-PCR with human brain RNA as template using the primer pair 5′-CTC CGC GGA CCC GAG CCC GTG GGA ACT C-3′ and 5′-GTG AAT TCT GGC TCC AGC TCT CGG GAG AG-3′. Two point mutations, T781A and F782A, which eliminate the guanine nucleotide exchange activity of Epac (21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar), were created using site-directed mutagenesis with the QuikChange kit from Stratagene. Citrine with the monomeric mutation A206K and Renilla luciferase (RL) were amplified by PCR using primer pairs: 5′-ATG GAT CCA TGG TGA GCA AGG GCG AG-3′ and 5′-CCG CGG AGC TTG TAC AGC TCG TCC ATG-3′;5′-GAA TTC ATG GCT TCC AAG GTG TAC G-3′ and 5′-GCG GCC GCT TAC TGC TCG TTC TTC AGC-3′. Fragments were then fused to the N and C termini of Epac1 as shown in Fig. 1. Circularly permuted citrine was generated by sewing PCR; constructs were equivalent to those described for the improved YFP, Venus (34Nagai T. Yamada S. Tominaga T. Ichikawa M. Miyawaki A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 10554-10559Crossref PubMed Scopus (849) Google Scholar). pcDNA3.1-His from Invitrogen was used for expression in mammalian cells; pQE30 from Qiagen was used for expression in bacteria. The pFB-neo vector from Stratagene was used to deliver the cAMP sensor into RAW 264.7 cells via retroviral infection.Cell Culture and Transfection—Protocols for culturing RAW 264.7 cells and for transfection of DNA and siRNA or retroviral infection can be found at the AfCS website. Briefly, RAW 264.7 cells (obtained from ATCC) and HEK293 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mml-glutamine, and 20 mm NaHEPES, pH 7.4. Transfection with DNA was carried out using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Retrovirus was made with the Phoenix Amphotropic packaging cell line (Orbigen). Infection of RAW cells was initiated by applying virus-containing supernatant harvested from the packaging cell line with 6 μg/ml polybrene on top of the cells and spinning at 1,200 × g at 32 °C for 2 h. Cells were then cultured with the viral supernatant for 1 day at 32 °C followed by removal of the viral medium and further culturing with fresh medium containing 500 μg/ml G418 at 37 °C.Gene Knockdown by RNAi—siRNA pools of oligomers targeting S1P1, S1P2, and Gα13 were SMARTPool products purchased from Dharmacon. The sequence for the S1P2-B oligomer (5′-GCA TGT CAC TCT GTC CTT A-3′) is unique from those in the SMARTPool. RAW cells were transfected with 400 nm siRNA using Lipofectamine 2000. Cells were plated into 96-well tissue culture plates at 24 h post-transfection and assayed at 48-h post-transfection. Samples were taken for Western blot or qRT-PCR to assess the knockdown level of protein or mRNA, respectively. Cells were lysed and blotted with antiserum B-860 to detect Gα13 as described (35Singer W. Miller R. Sternweis P. J. Biol. Chem. 1994; 269: 19796-19802Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Respective primers for qRT-PCR of the S1P1 and S1P2 receptors are: (F) 5′-CGG TGT AGA CCC AGA GTC CTG-3′ and (R) 5′-TTC TTT TAT GGA GCT TTT CCT TGG-3′; (F) 5′-AGC CAA CAG TCT CCA AAA CCA-3′ and (R) 5′-GGG CTG AGC ACT GGC TAG G-3′. The qRT-PCR reactions were done with an ABI 7500 Real-Time PCR system from Applied Biosystems.EIA Assay for cAMP—Cells were plated on 96-well tissue culture plates 1 day prior to the treatment with ligands. Prior to treatments, cells were cultured in serum-free medium for 1 h. Ligands were then added to stimulate the cells. After the addition of ligands, reactions were stopped at the indicated times by removal of medium and cell lysis with 65% ethanol. Cell lysates were then dried and assayed using the cAMP Biotrak EIA kit (Amersham Biosciences).Measurement of Fluorescence in Vitro—Cells that express the CAMYEL sensor were lysed with buffer containing 20 mm NaHEPES, pH 7.4, 50 mm KCl, 50 mm NaCl, 2.5 mm MgCl2, 0.2% Nonidet P-40, 5 mm dithiothreitol, and a mixture of protease inhibitors (Roche Applied Science). Bacterial expressed protein with an N-terminal His6 tag was purified with Ni-NTA resin. Coelenterazine-h (2 μm final concentration) was added to the cell lysates or purified proteins immediately prior to measurements of fluorescence emission spectra using a Spectrofluorometer MD-5020 (Photon Technology International).Assay of BRET in Live Cells—Cells were plated in 96-well solid white tissue culture plates (Greiner) at a density of 60,000 cells per well the day before assays. Cells were serum-starved in Hank's balanced salt solution, pH 7.4, for 1 h before treatments. The BRET assay was carried out with a POLARstar Optima plate reader from BMG LabTech. Emission signals from RL and YFP were measured simultaneously using a BRET1 filter set (475-30/535-30). Cells in each well were assayed in 80 μl of Hank's balanced salt solution with 2 μm coelenterazine-h, and stimulations were initiated by injection of 20 μl of 5× ligand.Calculation of cAMP Concentration—Ratiometric data were converted to cAMP concentration using Equation 1.[cAMP]=Kd×{(R-Rmin)(Rmax-R)}Eq. 1 The Kd and Hill coefficient for association of cAMP with the sensor were determined to be 8.8 μm and 1, respectively. R is the intensity ratio of RL to YFP. Rmax is obtained by adding 2 mm 8-bromo cAMP to the cells at the end of the assay. Rmin is arbitrarily set to be the average ratio of measurements with unstimulated cells minus 4 S.D. (see supplementary data for details).RESULTSAn Epac-based BRET Sensor for cAMP-CAMYEL—Several FRET sensors for detection of cAMP have been described in recent articles (19DiPilato L.M. Cheng X. Zhang J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 16513-16518Crossref PubMed Scopus (385) Google Scholar, 20Nikolaev V.O. Bunemann M. Hein L. Hannawacker A. Lohse M.J. J. Biol. Chem. 2004; 279: 37215-37218Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (582) Google Scholar, 21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). Because the sensor containing an inactive cytosolic mutant form of human Epac-1 appeared to have the best signal-to-noise ratio (21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar), it was used as a basis for development of a BRET sensor. The design of the sensor is shown in Fig. 1A; it utilizes the enhanced variant of YFP, citrine (36Griesbeck O. Baird G.S. Campbell R.E. Zacharias D.A. Tsien R.Y. J. Biol. Chem. 2001; 276: 29188-29194Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (843) Google Scholar), and Renilla luciferase as the BRET pair with human Epac1 inserted in between. Spectra of the expressed sensor protein revealed strong resonance energy transfer that was significantly reduced in response to cAMP, as expected from the FRET sensors and known structural changes in the molecule (21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar, 37Rehmann H. Das J. Knipscheer P. Wittinghofer A. Bos J.L. Nature. 2006; 439: 625-628Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 38Rehmann H. Prakash B. Wolf E. Rueppel A. de Rooij J. Bos J.L. Wittinghofer A. Nat. Struct. Biol. 2003; 10: 26-32Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar).We sought to further improve the signal by replacing citrine with circularly permuted versions of the protein. Such circular permutations of the fluorescent proteins have been shown to vastly improve the FRET signal in a sensor for calcium (34Nagai T. Yamada S. Tominaga T. Ichikawa M. Miyawaki A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 10554-10559Crossref PubMed Scopus (849) Google Scholar). This improvement in FRET efficiency may be due to altered fluorophore orientation of the permuted proteins, and we reasoned that similar changes would apply to the efficiency of BRET sensors. Of the five different circular permutations screened, we found that replacement of citrine with citrine-cp229 improved the changes of BRET ratio upon binding cAMP by 2-fold (Fig. 1). The improved sensor gives an increase in BRET ratio (Rluc/YFP) of about 70% with cAMP and was named CAMYEL (cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc).The CAMYEL protein was expressed in bacteria and purified for further characterization. A concentration response analysis with cAMP indicated a Kd and n (Hill coefficient) for binding of 8.8 μm and 1, respectively (supplemental Fig. S1); these are similar to binding properties reported for the FRET sensor (21Ponsioen B. Zhao J. Riedl J. Zwartkruis F. van der Krogt G. Zaccolo M. Moolenaar W.H. Bos J.L. Jalink K. EMBO Rep. 2004; 5: 1176-1180Crossref PubMed Scopus (355) Google Scholar). While the activity of luciferase can be influenced by calcium, resonance energy transfer should be independent of these changes in absolute signals if calcium does not cause any conformational changes in the sensor protein. This appears to be the case because the BRET ratios, either in the presence or absence of cAMP, were not influenced by concentrations of calcium up to 1 mm (supplemental Fig. S2). Additional experiments indicated that the BRET signals were also independent of changes in pH within the tested range (pH 6.5-8.0, supplemental Fig. S2). The response time of the sensor was assessed by measured changes in BRET when the sensor was exposed to abrupt increases or decreases in cAMP. Such changes depend on both the association and dissociation of cAMP and the ensuing changes in conformation. In vitro, the change of BRET ratio in response to altered cAMP concentrations appears to be complete within 1 to 2 s (supplemental Fig. S3). This rate of signal change is well suited for measuring the kinetics of change in intracellular concentrations of cAMP.Regulation of Cytosolic cAMP in RAW 264.7 Cells—One of the outputs measured in a survey by the Alliance for Cellular Signaling for the complexity of interactions among signaling pathways was the regulation of the classical second messenger, cAMP. A traditional enzyme-linked immunoassay (EIA) for total intracellular cAMP was used to identify two ligands, isoproterenol (ISO) and prostaglandin E2 (PGE), which effectively increased this second messenger in RAW cells. These two ligands were subjected to a comprehensive double ligand screen with over twenty additional ligands to look for non-additive interactions (23Natarajan M. Lin K-M. Hsueh R.C. Sternweis P.C. Ranganathan R. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 571-580Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar). Ligands that elicit calcium responses in RAW cells, such as complement C5a and uridine 5′-diphosphate (UDP), enhanced cAMP responses triggered by ISO or PGE. Interestingly, S1P, which at best induced only minimal cAMP or calcium responses in RAW cells by itself, enhanced the cAMP response to the ISO or PGE by 2-3-fold (Fig. 2A). To study these synergistic interactions in detail, cell lines that stably express the sensor for cytosolic cAMP, CAMYEL, were derived from RAW 264.7 cells. The level of expression of the CAMYEL sensor in the RAW 264.7 cells was estimated to be about 100 nm based on comparative Western blots. These cells produced normal calcium and cAMP (as measured by EIA) responses to an array of ligands. In such cell lines the BRET ratio, RLuc/YFP, can then be used to continuously monitor intracellular cAMP in real time (Fig. 2B). The dynamic range of the sensor in RAW cells was measured using 2 mm 8-bromo cAMP, a cell-permeable analog of cAMP, to saturate the sensor in vivo.FIGURE 2Measurement of intracellular cAMP responses in RAW 264.7 cells. A, changes in cAMP measured by EIA. At time 0, cells were stimulated with 16 nm ISO, 16 nm ISO and 0.5 μm UDP, 16 nm ISO and 10 nm S1P, or 50 nm S1P as indicated. At the given times, reactions were stopped by removal of medium and addition of cell lysis solution, and cAMP was determined by EIA. The results shown are the average of three independent experiments done with two different preparations of cells: the variance among the experiments is about 30% of the signals. B, measurement of cAMP responses using the CAMYEL sensor. Emission ratios (RL/YFP) were measured in RAW 264.7 cells stably expressing the CAMYEL sensor. Cells were stimulated at time 0 by addition of either 16 nm ISO 16 nm ISO and 0.5 μm UDP, 16 nm ISO and 10 nm S1P, 10 nm S1P, 2.5 μm UDP, or 2 mm 8-bromo cAMP as indicated. C, ratiometric measurements of CAMYEL responses were converted to intracellular concentrations of cAMP.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Stimulation of β-adrenergic receptors with ISO led to rapid decreases of the BRET signal hence increases of the fluorescence intensity ratio, Rluc/YFP (Fig. 2B). The response peaked at ∼20-30 s after addition of ligand and declined to a sustained level. This response profile is qualitatively the same as measured by EIA. The BRET sensor also recapitulates the effect of S1P and UDP on production of cAMP. Addition of either S1P or UDP alone elicited minimal cAMP responses (Fig. 2B), although UDP stimulates robust increases in intracellular calcium in RAW cells. This confirms in vitro results that calcium does not affect the BRET ratio of the sensor. Simultaneous addition of either S1P or UDP together with ISO led to greater changes in BRET at the peak of the response and subsequent decreases over time to a sustained level that was equivalent to that obtained with the addition of ISO alone.To better assess the dynamics of changes in intracellular cAMP, we converted the ratiometric results shown in Fig. 2B to concentrations of cAMP (Fig. 2C, see “Experimental Procedures” and supplementary information). Using this method of conversion, we can then compare quantitative changes in cAMP measured with the BRET sensor to those obtained with the EIA. As shown in Fig. 2C, S1P or UDP synergistically increases the peak cAMP response induced by ISO alone by 2-4 or 1.5-2 folds, respectively. This slightly higher ratio of enhancement than that observed with EIA is likely due to two differences in the assessments. First, the peak response is usually missed by the EIA. Second, the sensor measures free intracellular cAMP, whereas the EIA also measures bound nucleotide that will be proportionally higher at lower concentrations.Enhancement of cAMP by S1P Is Caused by Increased Synthesis of cAMP—Use of the CAMYEL sensor allows us to dissect the effect of S1P on cAMP through detailed kinetic measurements. The intracellular concentration of cAMP is determined by a dynamic balance between its biosynthesis via adenylyl cyclases and its degradation by phosphodiesterases. The enhancement observed with S1P could be due to either stimulation of synthesis or inhibition of degradation. We first compared rates of cAMP increases when cells were stimulated by either ISO alone or combination of ISO and S1P. The synergistic effect of S1P is observed at the earliest times after ligand addition with a greater than 4-fold increase in rate throughout the approach to peak values (Fig. 3, filled symbols). This suggests that the enhancement by S1P is temporally well-coupled to the early processes causing activation of ACs.FIGURE 3Effect of S1P on intracellular cAMP has a fast onset and is not affected by inhibitors of phosphodiesterases. The CAMYEL sensor was used to measure the rise in cAMP when cells were treated with 16 nm ISO or 16 nm ISO and 10 nm S1P either in the absence or in the presence of the phosphodiesterase inhibitors (PDEi), 10 μm Ro20-1724 and 40 μm isobutylmethylxanthine. Ligands were added at time 0, PDEi were added 2 min prior to ligand addition, which was sufficient to cause maximum impact of the inhibitors.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res i

ABSTRACT Comprehensive and efficient gene hit selection from high throughput assays remains a critical bottleneck in realizing the potential of genome-scale studies in biology. Widely used methods such as setting of cutoffs, prioritizing pathway enrichments, or incorporating predicted network interactions offer divergent solutions yet are associated with critical analytical trade-offs, and are often combined in an ad hoc manner. The specific limitations of these individual approaches, the lack of a systematic way by which to integrate their rankings, and the inaccessibility of complex computational approaches to many researchers, has contributed to unexpected variability and limited overlap in the reported results from comparable genome-wide studies. Using a set of three highly studied genome-wide datasets for HIV host factors that have been broadly cited for their limited number of shared candidates, we characterize the specific complementary contributions of commonly used analysis approaches and find an optimal framework by which to integrate these methods. We describe Throughput Ranking by Iterative Analysis of Genomic Enrichment (TRIAGE), an integrated, iterative approach which uses pathway and network statistical methods and publicly available databases to optimize gene prioritization. TRIAGE is accessible as a secure, rapid, user-friendly web-based application ( https://triage.niaid.nih.gov ). Graphical Abstract

Abstract Measurement of gene expression at the single-cell level has led to important advances in the study of transcriptional regulation programs in healthy and disease states. In particular, single-cell gene expression approaches have shed light on the high level of transcriptional heterogeneity of individual cells, both at baseline and in response to experimental or environmental perturbations. We have developed a method for High-Content Imaging (HCI)-based quantification of transcript abundance at the single-cell level in primary human immune cells and have validated its performance under multiple experimental conditions to demonstrate its general applicability. This method, which we abbreviate as hcHCR, combines the high sensitivity of the hybridization chain reaction (HCR) for the visualization of mRNA molecules in single cells, with the speed, scalability, and technical reproducibility of HCI. We first tested eight microscopy-compatible attachment substrates for short-term culture of primary human B cells, T cells, monocytes, or neutrophils. We then miniaturized HCR in a 384-well format and documented the ability of the method to detect increased or decreased transcript abundance at the single-cell level in thousands of cells for each experimental condition by HCI. Furthermore, we demonstrated the feasibility of multiplexing gene expression measurements by simultaneously assaying the abundance of two transcripts per cell, both at baseline and in response to an experimental stimulus. Finally, we tested the robustness of the assay to technical and biological variation. We anticipate that hcHCR will be a suitable and cost-effective assay for low- to medium-throughput chemical, genetic or functional genomic screens in primary human cells, with the possibility of performing personalized screens or screens on cells obtained from patients with a specific disease.

Deep learning is rapidly becoming the technique of choice for automated segmentation of nuclei in biological image analysis workflows. In order to improve and understand the training parameters that drive the performance of deep learning models trained on small, custom annotated image datasets, we have designed a computational pipeline to systematically test different nuclear segmentation model architectures and model training strategies. Using this approach, we demonstrate that transfer learning and tuning of training parameters, such as the training image dataset composition, size and pre-processing, can lead to robust nuclear segmentation models, which match, and often exceed, the performance of existing, state-of-the-art deep learning models pre-trained on large image datasets. Our work provides computational tools and a practical framework for the improvement of deep learning-based biological image segmentation using small annotated image datasets.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.