Abstract The restrictor, ZC3H4/WDR82, is the major termination factor for antisense transcription from bidirectional promoters, but its mechanism is poorly understood. We report that ZC3H4/WDR82 co-purifies with PP1 phosphatase and PP1 phosphatase nuclear targeting subunit, PNUTS, which binds directly to the WDR82 subunit of restrictor. AlphaFold predicts a quaternary complex, PPWZ, in which P P1-associated P NUTS and Z C3H4 both contact W DR82. To investigate the role of protein dephosphorylation in PPWZ activity, we expressed a substrate trap comprising inactive PP1 H66K linked to the PNUTS C-terminus. PP1 H66K -PNUTS binds pol II large subunit and nuclear exosome components. PP1 H66K -PNUTS, but not PP1 WT -PNUTS, functions as a dominant-negative inhibitor of antisense termination and CTD Ser5 dephosphorylation. Both these activities require the PNUTS WDR82 binding domain that interacts with restrictor. We show that CTD Ser5 hyperphosphorylation is associated with higher processivity and reduced pausing that would counteract termination, and propose that Ser5 dephosphorylation by PPWZ is coupled to termination. In summary, we identify the PP1 phosphatase activity of the PPWZ complex as essential for terminator function and propose that this heterotetramer is the physiologically relevant form of restrictor.

The recognition of 5' splice site (5' ss) is one of the earliest steps of pre-mRNA splicing. To better understand the mechanism and regulation of 5' ss recognition, we selectively humanized components of the yeast U1 snRNP to reveal the function of these components in 5' ss recognition and splicing. We targeted U1C and Luc7, two proteins that interact with and stabilize the yeast U1 (yU1) snRNA and the 5' ss RNA duplex. We replaced the Zinc-Finger (ZnF) domain of yU1C with its human counterpart, which resulted in cold-sensitive growth phenotype and moderate splicing defects. Next, we added an auxin-inducible degron to yLuc7 protein and found that Luc7-depleted yU1 snRNP resulted in the concomitant loss of PRP40 and Snu71 (two other essential yeast U1 snRNP proteins), and further biochemical analyses suggest a model of how these three proteins interact with each other in the U1 snRNP. The loss of these proteins resulted in a significant growth retardation accompanied by a global suppression of pre-mRNA splicing. The splicing suppression led to mitochondrial dysfunction as revealed by a release of Fe 2+ into the growth medium and an induction of mitochondrial reactive oxygen species. Together, these observations indicate that the human U1C ZnF can substitute that of yeast, Luc7 is essential for the incorporation of the Luc7-Prp40-Snu71 trimer into yeast U1 snRNP, and splicing plays a major role in the regulation of mitochondria function in yeast.

Abstract Rationale Cardiomyocytes and fibroblasts in the heart communicate through both secreted growth factors as well as through sensing the structural properties of the extracellular matrix that each helps generate. Previous studies have shown that defects in fibroblast activity during disease stimulation result in altered cardiomyocyte hypertrophy, although the role that collagen might play in this communication is unknown. Objective Here we investigated how type I collagen maturation and disease-responsive matrix expansion in the heart by cardiac fibroblasts impacts cardiac fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy. Methods and Results We generated and characterized Col1a2 -/- mice using standard gene-targeting. Col1a2 -/- mice were viable, although by young adulthood their hearts showed alterations in extracellular matrix mechanical properties, as well as an unanticipated activation of cardiac fibroblasts and induction of a progressive fibrotic response. This included increases in fibroblast number and a progressive cardiac hypertrophy, with reduced functional performance by 9 months. Col1a2-loxP targeted mice were also generated and crossed with the tamoxifen-inducible Postn-MerCreMer knock-in mice to delete the Col1a2 gene in myofibroblasts post-pressure overload injury, to more specifically implicate fibroblasts as effectors of cardiomyocyte hypertrophy in vivo. Opposite to the gradual induction of cardiac hypertrophy observed in germline Col1a2 -/- mice as they matured developmentally, adult fibroblast-specific deletion of Col1a2 during pressure overload protected these mice from cardiac hypertrophy in the first week with a delayed fibrotic response. However, this reduction in hypertrophy due to myofibroblast-specific Col1a2 deletion was gradually lost over 2 and 6 weeks of pressure overload as augmented fibrosis returned. Conclusions Defective type I collagen in the developing heart alters the structural integrity of the extracellular matrix that leads to fibroblast expansion, activation, fibrosis and hypertrophy with progressive cardiomyopathy in adulthood. However, acute deletion of type I collagen production for the first time in the adult heart during pressure overload prevents ECM expansion and inhibits cardiomyocyte hypertrophy, while gradual restoration of fibrosis again permitted hypertrophy comparable to controls.

Abstract New treatments that circumvent the pitfalls of traditional antivenom therapies are critical to address the problem of snakebite globally. Numerous snake venom toxin inhibitors have shown promising cross-species neutralization of medically significant venom toxins in vivo and in vitro . The development of high-throughput approaches for the screening of such inhibitors could accelerate their identification, testing, and implementation, and thus holds exciting potential for improving the treatments and outcomes of snakebite envenomation worldwide. Energetics-based proteomic approaches, including Thermal Proteome Profiling (TPP) and Proteome Integral Solubility Alteration (PISA), assays represent “deep proteomics” methods for high throughput, proteome-wide identification of drug targets and ligands. In the following study, we apply TPP and PISA methods to characterize the interactions between venom toxin proteoforms in Crotalus atrox (Western Diamondback Rattlesnake) and the snake venom metalloprotease (SVMP) inhibitor marimastat. We investigate its venom proteome-wide effects and characterize its interactions with specific SVMP proteoforms, as well as its potential targeting of non-SVMP venom toxin families. We also compare the performance of PISA thermal window and soluble supernatant with insoluble precipitate using two inhibitor concentrations, providing the first demonstration of the utility of a sensitive high-throughput PISA-based approach to assess the direct targets of small molecule inhibitors for snake venom.

Abstract Collagen cross-links created by the lysyl oxidase and lysyl hydroxylase families of enzymes are a significant contributing factor to the biomechanical strength and rigidity of tissues, which in turn influence cell signaling and ultimately cell phenotype. In the clinic, the proteolytically liberated N-terminal cross-linked peptide of collagen I (NTX) is used as a biomarker of bone and connective tissue turnover, which is altered in several disease processes. Despite the clinical utility of these collagen breakdown products, the majority of the cross-linked peptide species have not been identified in proteomic datasets. Here we evaluate several parameters for the preparation and identification of these peptides from the collagen I-rich Achilles tendon. Our refined approach involving chemical digestion for protein solubilization coupled with mass spectrometry allows for the identification of the NTX cross-links in a range of modification states. Based on the specificity of the enzymatic cross-linking reaction we utilized follow-up variable modification searches to facilitate identification with a wider range of analytical workflows. We then applied a spectral library approach to identify differences in collagen cross-links in bovine pulmonary hypertension. The presented method offers unique opportunities to understand extracellular matrix remodeling events in development, aging, wound healing, and fibrotic disease that modulate collagen architecture through lysyl-hydroxylase and lysyl-oxidase enzymes.

Abstract The puff adder ( Bitis arietans ) is a highly venomous viperid snake responsible for many fatalities in Africa, yet despite this there have been few comprehensive analyses of its venom proteins, particularly of the proteases that play a key role in envenoming. This study set out to isolate and characterise the most abundant serine proteases and metalloproteases found in venoms of puff adders obtained from Nigeria, Tanzania and Kenya. All three contained both classes of protease, but there were clear regional differences in the types of protease and their activities. Prominent in all three venoms was an SVMP PII-a. This protease varied in degree of glycosylation between the three sources, and also in its activity. The protease isolated from Tanzanian venoms, which was non-glycosylated, proved to be highly potent, and very destructive towards laminin in particular. The SVMP PIII content of the three venoms was quite low, but in some Kenyan venoms a prominent 68 kDa SVMP PIII was found which has a novel non-covalent dimeric structure and was strongly gelatinolytic, an activity that was not observed in any of the other SVMPs identified here. The Nigerian venoms were rich in an interesting set of serine proteases (SVSPs), the main forms of which were isolated and characterised. Two distinct groups were identified: trypsin-like acidic SVSPs and chymotrypsin-like basic SVSPs, each with different activities. The acidic SVSP is responsible for the gelatinase activity observed in the Nigerian venom, which is a novel form of activity for SVSPs. This regional diversity in venom protease activities is discussed with reference to the implications it will have in the development of therapeutic interventions.

Identification and characterization of snake venom toxins that interfere with hemostasis have important implications for the treatment of snake envenomation, the bioprospecting of therapeutically useful molecules, and the development of research tools for investigating hematologic disorders. Many venoms have been shown to possess thrombolytic activity. However, it remains unclear if actions on other clot-stabilizing proteins beyond fibrin chains contribute significantly to venom-induced thrombolysis because the clot-wide targets of venom proteases and the mechanisms responsible for thrombolysis are not well understood. Here, we utilize a high-throughput time-based thrombolysis assay in combination with untargeted peptidomics to provide comprehensive insight into the effects of venom from six snake species on blood clot degradation. We compare thrombolytic profiles across venoms with variable levels of proteases and generate venom-specific fingerprints of cleavage specificity. We also compare the specific effects of venoms that possess a range of thrombolytic activity on fibrin subunits and other clot-bound proteins involved in clot structure. Venoms with higher thrombolytic activity demonstrated an enhanced ability to target multiple sites across fibrin chains critical to clot stability and structure, as well as clot-stabilizing proteins including fibronectin and vitronectin. Collectively, this study significantly expands our understanding of the thrombolytic and fibrinolytic effects of snake venom by determining the full suite of clot-specific venom targets that are involved in clot formation and stability.

The EphB4-ephrinB2 signaling axis has been heavily implicated in metastasis across numerous cancer types. Our emerging understanding of the dichotomous roles that EphB4 and ephrinB2 play in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) poses a significant challenge to rational drug design. We find that EphB4 knockdown in cancer cells enhances metastasis in preclinical HNSCC models by augmenting immunosuppressive cells like T regulatory cells (Tregs) within the tumor microenvironment. EphB4 inhibition in cancer cells also amplifies their ability to metastasize through increased expression of genes associated with epithelial mesenchymal transition and hallmark pathways of metastasis. In contrast, vascular ephrinB2 knockout coupled with radiation therapy (RT) enhances anti-tumor immunity, reduces Treg accumulation into the tumor, and decreases metastasis. Notably, targeting the EphB4-ephrinB2 signaling axis with the engineered EphB4 ligands EFNB2-Fc-His and Fc-TNYL-RAW-GS reduces local tumor growth and distant metastasis in a preclinical model of HNSCC. Our data suggest that targeted inhibition of vascular ephrinB2 while avoiding inhibition of EphB4 in cancer cells could be a promising strategy to mitigate HNSCC metastasis.

Abstract Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) is a deadly cancer with poor response to targeted therapy, largely driven by an immunosuppressive tumor microenvironment (TME). Here we examine the immune-modulatory role of the receptor tyrosine kinase EphA4 in HNSCC progression. Within the TME, EphA4 is primarily expressed on regulatory T cells (Tregs) and macrophages. In contrast ephrinB2, an activating ligand of EphA4, is expressed in tumor blood vessels. Using genetically engineered mouse models, we show that EphA4 expressed in Tregs promotes tumor growth, whereas EphA4 expressed in monocytes inhibits tumor growth. In contrast, ephrinB2 knockout in blood vessels reduces both intratumoral Tregs and macrophages. A novel specific EphA4 inhibitor, APY-d3-PEG4, reverses the accelerated tumor growth we had previously reported with EphB4 cancer cell knockout. EphA4 knockout in macrophages not only enhanced their differentiation into M2 macrophage but also increased Treg suppressive activity. APY-d3-PEG4 reversed the accelerated growth seen in the EphA4 knockout of monocytes but conferred no additional benefit when EphA4 was knocked out on Tregs. Underscoring an EphA4-mediated interplay between Tregs and macrophages, we found that knockout of EphA4 in Tregs not only decreases their activation but also reduces tumor infiltration of pro-tumoral M2 macrophages. These data identify Tregs as a primary target of APY-d3-PEG4 and suggest a role for Tregs in regulating macrophage conversion. These data also support the possible anti-cancer therapeutic value of bispecific peptides or antibodies capable of promoting EphA4 blockade in Tregs but not macrophages. Significance EphA4 in regulatory T cells has a pro-tumoral effect while EphA4 in macrophages plays an anti-tumoral role underscoring the necessity of developing biologically rational therapeutics.

Snakebite envenoming is a neglected tropical disease that causes substantial mortality and morbidity globally. The venom of African spitting cobras often causes permanent injury via tissue-destructive dermonecrosis at the bite site, which is ineffectively treated by current antivenoms. To address this therapeutic gap, we identified the aetiological venom toxins responsible for causing local dermonecrosis. While cytotoxic three-finger toxins were primarily responsible for causing spitting cobra cytotoxicity in cultured keratinocytes, their potentiation by phospholipases A2 toxins was essential to cause dermonecrosis in vivo. This evidence of probable toxin synergism suggests that a single toxin-family inhibiting drug could prevent local envenoming. We show that local injection with the repurposed phospholipase A2-inhibiting drug varespladib significantly prevents local tissue damage caused by several spitting cobra venoms in murine models of envenoming. Our findings therefore provide a new therapeutic strategy to more effectively prevent life-changing morbidity caused by snakebite in rural Africa.