Inflammation is a beneficial host response to infection but can contribute to inflammatory disease if unregulated. The Th17 lineage of T helper (Th) cells can cause severe human inflammatory diseases. These cells exhibit both instability (they can cease to express their signature cytokine, IL-17A) and plasticity (they can start expressing cytokines typical of other lineages) upon in vitro re-stimulation. However, technical limitations have prevented the transcriptional profiling of pre- and post-conversion Th17 cells ex vivo during immune responses. Thus, it is unknown whether Th17 cell plasticity merely reflects change in expression of a few cytokines, or if Th17 cells physiologically undergo global genetic reprogramming driving their conversion from one T helper cell type to another, a process known as transdifferentiation. Furthermore, although Th17 cell instability/plasticity has been associated with pathogenicity, it is unknown whether this could present a therapeutic opportunity, whereby formerly pathogenic Th17 cells could adopt an anti-inflammatory fate. Here we used two new fate-mapping mouse models to track Th17 cells during immune responses to show that CD4(+) T cells that formerly expressed IL-17A go on to acquire an anti-inflammatory phenotype. The transdifferentiation of Th17 into regulatory T cells was illustrated by a change in their signature transcriptional profile and the acquisition of potent regulatory capacity. Comparisons of the transcriptional profiles of pre- and post-conversion Th17 cells also revealed a role for canonical TGF-β signalling and consequently for the aryl hydrocarbon receptor (AhR) in conversion. Thus, Th17 cells transdifferentiate into regulatory cells, and contribute to the resolution of inflammation. Our data suggest that Th17 cell instability and plasticity is a therapeutic opportunity for inflammatory diseases.

Abstract Osteosarcoma is the most frequent primary bone tumor with poor prognosis. Through RNA-sequencing of 100,987 individual cells from 7 primary, 2 recurrent, and 2 lung metastatic osteosarcoma lesions, 11 major cell clusters are identified based on unbiased clustering of gene expression profiles and canonical markers. The transcriptomic properties, regulators and dynamics of osteosarcoma malignant cells together with their tumor microenvironment particularly stromal and immune cells are characterized. The transdifferentiation of malignant osteoblastic cells from malignant chondroblastic cells is revealed by analyses of inferred copy-number variation and trajectory. A proinflammatory FABP4 + macrophages infiltration is noticed in lung metastatic osteosarcoma lesions. Lower osteoclasts infiltration is observed in chondroblastic, recurrent and lung metastatic osteosarcoma lesions compared to primary osteoblastic osteosarcoma lesions. Importantly, TIGIT blockade enhances the cytotoxicity effects of the primary CD3 + T cells with high proportion of TIGIT + cells against osteosarcoma. These results present a single-cell atlas, explore intratumor heterogeneity, and provide potential therapeutic targets for osteosarcoma.

Abstract Understanding the liver stem cells (LSCs) holds great promise for new insights into liver diseases and liver regeneration. However, the heterogenicity and plasticity of liver cells have made it controversial. Here, by employing single‐cell RNA‐sequencing technology, transcriptome features of Krt19 + bile duct lineage cells isolated from Krt19CreERT; Rosa26R‐GFP reporter mouse livers are examined. Distinct biliary epithelial cells which include adult LSCs, as well as their downstream hepatocytes and cholangiocytes are identified. Importantly, a novel cell surface LSCs marker, CD63, as well as CD56, which distinguished active and quiescent LSCs are discovered. Cell expansion and bi‐potential differentiation in culture demonstrate the stemness ability of CD63 + cells in vitro. Transplantation and lineage tracing of CD63 + cells confirm their contribution to liver cell mass in vivo upon injury. Moreover, CD63 + CD56 + cells are proved to be activated LSCs with vigorous proliferation ability. Further studies confirm that CD63 + CD56 − quiescent LSCs express VEGFR2 and FGFR1, and they can be activated to proliferation and differentiation through combination of growth factors: VEGF‐A and bFGF. These findings define an authentic adult liver stem cells compartment, make a further understanding of fate regulation on LSCs, and highlight its contribution to liver during pathophysiologic processes.

Abstract Background Germline mutations have been identified in a small number of hereditary cancers, but the genetic predisposition for many familial cancers remains to be elucidated. Methods This study identified a Chinese pedigree that presented different cancers (breast cancer, BRCA; adenocarcinoma of the esophagogastric junction, AEG; and B‐cell acute lymphoblastic leukemia, B‐ALL) in each of the three generations. Whole‐genome sequencing and whole‐exome sequencing were performed on peripheral blood or bone marrow and cancer biopsy samples. Whole‐genome bisulfite sequencing was conducted on the monozygotic twin brothers, one of whom developed B‐ALL. Results According to the ACMG guidelines, bioinformatic analysis of the genome sequencing revealed 20 germline mutations, particularly mutations in the DNAH11 (c.9463G > A) and CFH (c.2314G > A) genes that were documented in the COSMIC database and validated by Sanger sequencing. Forty‐one common somatic mutated genes were identified in the cancer samples, displaying the same type of single nucleotide substitution Signature 5. Meanwhile, hypomethylation of PLEK2, MRAS, and RXRA as well as hypermethylation of CpG island associated with WT1 was shown in the twin with B‐ALL. Conclusions These findings reveal genomic alterations in a pedigree with multiple cancers. Mutations found in the DNAH11, CFH genes, and other genes predispose to malignancies in this family. Dysregulated methylation of WT1, PLEK2, MRAS, and RXRA in the twin with B‐ALL increases cancer susceptibility. The similarity of the somatic genetic changes among the three cancers indicates a hereditary impact on the pedigree. These familial cancers with germline and somatic mutations, as well as epigenomic alterations, represent a common molecular basis for many multiple cancer pedigrees.

ABSTRACT DNA methylation is essential for a wide variety of biological processes, yet the development of a highly efficient and robust technology remains a challenge for routine single-cell analysis. We developed a multiplex scalable single-cell reduced representation bisulfite sequencing (msRRBS) technology with off-the-shelf reagents and equipment. It allows cell-specific barcoded DNA fragments of individual cells to be pooled before bisulfite conversion, free of enzymatic modification or physical capture of the DNA ends, and achieves unparalleled read mapping rates of 62.51%, covering 59.95% of CpG islands and 71.62% of promoters in K562 cells on average. Its reproducibility is shown in duplicates of bulk cells with near perfect correlation (R=0.97-99). At a low 1 Mb of clean reads, msRRBS provides consistent coverage of CpG islands and promoters, outperforming the conventional methods with orders of magnitude reduction in cost. Here, we use this method to characterize the distinct methylation patterns and cellular heterogeneity of 6 cell lines, and leukemia and hepatocellular carcinoma models. Taking 4 hours of hands-on time, msRRBS offers a unique, highly efficient approach for dissecting methylation heterogeneity in a variety of multicellular systems.

Abstract Single cell copy number variation sequencing (scCNV-seq) is valuable for genomic analysis of a variety of health and disease systems, yet the available methods either depend on either preamplification of the whole genome of each cell, special devices or untracable, which hinder scCNV-seq practice in clinics. Here we provide scalable multiplex scCNV-seq (msCNVS) that allows direct medium-throughput library construction for single cells, which are barcoded individually with Tn5 transposome in a microplate and immediately pooled for downstream processes, elevating the efficiency by orders of magnitude. An algorithm is developed on the distribution of segmented normalized read count density to identify the major peaks associating with integer copy numbers, further improving the accuracy for objective CNV calling. Here msCNVS faithfully distinguishes the unique CNV patterns of 5 cell lines. The individual msCNVS profiles of 70 individual K562 cells highly correlate with the profile of K562 bulk cells (R=0.90-0.98), and the triplicates of HeLa3 bulk cells correlated nearly perfect (R=0.99). The msCNVS CNV profiles of primary cell cultures of amniotic fluid are confirmed by G-banding karyotype analysis and chromosomal microarray analysis. Additionally, the coverage uniformity of msCNVS is superior to that of MDA and MALBAC and approaches what eMDA and DOP-PCR achieves. Furthermore, msCNVS detects CNV deletions in 2 stunted, abnormal blastocysts, one with CNV mosaicism, and uncovered variants of CNVs in circulated tumor cells, cancerous pleural effusion cells, and patient-derived xenograft nuclei. Thus, msCNVS promises a robust, reliable and highly efficient approach to genomic testing of precious and rare cells like those typically obtained in reproductive and cancer clinics. One-Sentence Summary By early pooling of multiple single cells individually barcoded with Tn5 transposome, msCNVS enables efficient CNV profiling of rare clinic samples

Schizophrenia is often associated with volumetric reductions in cortices and expansions in basal ganglia, particularly the putamen. Recent genome-wide association studies have highlighted the significance of variants in the 3' regulatory region adjacent to the kinectin 1 gene (

Osteosarcoma (OS) has high heterogeneity and poor prognosis. In order to explore the molecular mechanism of OS and the tumor micro-environment (TME) on OS, we employed single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) on 110,745 individual cells from OS primary lesion, recurrent focal and metastatic tissues. We identified 5 main malignant subpopulations of OS cells, 3 clusters of osteoclast(OC) and 2 types of cancer-associated fibroblasts (CAFs). Further we found that the progenitor OC and, antigen presenting CAF (apCAF) were lower in lung metastatic and recurrent tumor tissues than in primary tumor tissue. M2-like macrophages were predominant in the TME myeloid cells. Inactivation state of tumor-infiltrating T cells, mainly the CD4-/CD8- T and Treg cells, existed in lung metastatic tissues. T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) expressed in 11 samples. We then blocked TIGIT which significantly enhancd the cytotoxic effects of primary T cells on OS cell lines. Our report represents the first use of scRNA-seq for the transcriptomic profiling of OS cells. Thus, the findings in this study will serve as a valuable resource for deciphering the intra-tumoral heterogeneity in OS and provide potential therapeutic strategies for OS in clinic.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.