Abstract Increasing evidence suggests that mechanical cues inherent to the extracellular matrix (ECM) may be equally as critical as its chemical identity in regulating cell behavior. We hypothesized that the mechanical properties of the ECM directly regulate the motility of vascular smooth muscle cells (SMCs) and tested this hypothesis using polyacrylamide substrates with tunable mechanical properties. Quantification of the migration speed on uniformly compliant hydrogels spanning a range of stiffnesses (Young's moduli values from 1.0 to 308 kPa for acrylamide/bisacrylamide ratios between 5/0.1% and 15/1.2%, respectively) revealed a biphasic dependence on substrate compliance, suggesting the existence of an optimal substrate stiffness capable of supporting maximal migration. The value of this optimal stiffness shifted depending on the concentration of ECM protein covalently attached to the substrate. Specifically, on substrates presenting a theoretical density of 0.8 μg/cm 2 fibronectin, the maximum speed of 0.74 ± 0.09 μm/min was achieved on a 51.9 kPa gel; on substrates presenting a theoretical density of 8.0 μg/cm 2 fibronectin, the maximum speed of 0.72 ± 0.06 μm/min occurred on a softer 21.6 kPa gel. Pre‐treatment of cells with Y27632, an inhibitor of the Rho/Rho‐kinase (ROCK) pathway, reduced these observed maxima to values comparable to those on non‐optimal stiffnesses. In parallel, quantification of TritonX‐insoluble vinculin via Western blotting, coupled with qualitative fluorescent microscopy, revealed that the formation of focal adhesions and actin stress fibers also depends on ECM stiffness. Combined, these data suggest that the mechanical properties of the underlying ECM regulate Rho‐mediated contractility in SMCs by disrupting a presumptive cell‐ECM force balance, which in turn regulates cytoskeletal assembly and ultimately, cell migration. © 2005 Wiley‐Liss, Inc.

Hydrogels based on poly(ethylene glycol) (PEG) are of increasing interest for regenerative medicine applications and are ideal materials to direct cell function due to the ability to confer key functionalities of native extracellular matrix (ECM) on PEG's otherwise inert backbone. Given extensive recent evidence that ECM compliance influences a variety of cell functions, PEG-based hydrogels are also attractive due to the ease with which their mechanical properties can be controlled. In these studies, we exploited the chemical and mechanical tunability of PEG-based gels to study the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells (SMCs) in both 2-D and 3-D model systems. First, by controlling the extent of crosslinking and therefore the mechanical properties of PEG-based hydrogels (tensile moduli from 13.7 to 423.9 kPa), we report here that the assembly of F-actin stress fibers and focal adhesions, indicative of the state of actin contractility, were influenced by the compliance of 2-D PEG gels functionalized with either short adhesive peptides or full-length ECM proteins. Varying ECM ligand density and identity independent of gel compliance affected the physical properties of the focal adhesions, and also influenced SMC spreading in 2-D. Furthermore, SMCs proliferated to a greater extent as gel stiffness was increased. In contrast, the degree of SMC differentiation, which was qualitatively assessed by the extent of smooth muscle α-actin bundling and the association of calponin and caldesmon with the α-actin fibrils, was found to decrease with substrate stiffness in 2-D cultures. In 3-D, despite the fact that their viability and degree of spreading were greatly reduced, SMCs did express some contractile markers indicative of their differentiated phenotype when cultured within PEG–RGDS constructs. Combined, these data suggest that the mechanical and chemical properties of PEG hydrogels can be tuned to influence SMC phenotype in both 2-D and 3-D.

Abstract Bioengineers have built increasingly sophisticated models of the tumor microenvironment in which to study cell-cell interactions, mechanisms of cancer growth and metastasis, and to test new potential therapies. These models allow researchers to culture cells in conditions that include features of the in vivo tumor microenvironment (TME) implicated in regulating cancer progression, such as ECM stiffness, integrin binding to the ECM, immune and stromal cells, growth factor and cytokine depots, and a 3D geometry more representative of the TME than tissue culture polystyrene (TCPS). These biomaterials could be particularly useful for drug screening applications to make better predictions of efficacy, offering better translation to preclinical in vivo models and clinical trials. However, it can be challenging to compare drug response reports across different platforms and conditions in the current literature. This is, in part, as a result of inconsistent reporting and use of drug response metrics, and vast differences in cell growth rates across a large variety of biomaterial design. This perspective paper attempts to clarify the definitions of drug response measurements used in the field, and presents examples in which these measurements can and cannot be applied. We suggest as best practice to include appropriate controls, always measure the growth rate of cells in the absence of drug, and follow our provided “decision tree” matrix when reporting drug response metrics.

Cells sense and respond to mechanical cues from the extracellular matrix (ECM) via integrins. ECM stiffening is known to increase integrin clustering and sensitivity to epidermal growth factor (EGF), but we lack information on when or if these mechanosensitive growth factor receptors and integrins converge intracellularly. Towards closing this knowledge gap, we combined a biomaterial platform with transcriptomics, molecular biology, and functional assays to link integrin-mediated mechanosensing and epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling. We found that high integrin α6 expression controlled breast cancer cell adhesion and motility on soft, laminin-coated substrates, and this mimicked the response of cells to EGF stimulation. The mechanisms that drove both mechanosensitive cell adhesion and motility converged on calpain 2, an intracellular protease important for talin cleavage and focal adhesion turnover. EGF stimulation enhanced adhesion and motility on soft substrates, but required integrin α6 and calpain 2 signaling. In sum, we identified a new role for integrin α6 mechanosensing in breast cancer, wherein cell adhesion to laminin on soft substrates mimicked EGF stimulation. We identified calpain 2, downstream of both integrin α6 engagement and EGFR phosphorylation, as a common intracellular signaling node, and implicate integrin α6 and calpain 2 as potential targets to inhibit the migration of cancer cells in stiff tumor environments.

Michael-type addition reactions are widely used to polymerize biocompatible hydrogels. The thiol-maleimide modality achieves the highest macromer coupling efficiency of the reported Michael-type pairs, but the resulting hydrogel networks are heterogeneous, because polymerization is faster than the individual components can be manually mixed. The reactivity of the thiol dictates the overall reaction speed, which can be slowed in organic solvents and acidic buffers. Since these modifications also reduce the biocompatibility of resulting hydrogels, we investigated a series of biocompatible buffers and crosslinkers to decelerate gelation while maintaining high cell viability. We found that lowering the polymer weight percentage (wt%), buffer concentration, and pH slowed gelation kinetics, but crosslinking with an electronegative peptide was optimal for both kinetics and cell viability. Slowing the speed of polymerization resulted in more uniform hydrogels, both in terms of visual inspection and the diffusion of small molecules through the network. However, reactions that were too slow resulted in non-uniform particle dispersion due to settling, thus there is a trade-off in hydrogel network uniformity versus cell distribution in the hydrogels when using these networks in cell applications.

Cell motility is a critical aspect of wound healing, the immune response, and is deregulated in cancer. Current limitations in imaging tools make it difficult to study cell migration in vivo. To overcome this, and to identify drivers from the microenvironment that regulate cell migration, bioengineers have developed 2D and 3D tissue model systems in which to study cell motility in vitro, with the aim of mimicking the environments in which cells move in vivo. However, there has been no systematic study to explicitly relate and compare cell motility measurements between these geometries/systems. Here, we provide such analysis on our own data, as well as across data in existing literature to understand whether, and which, in vitro models are predictive of in vivo cell motility. To our surprise, many metrics of cell movement on 2D surfaces significantly and positively correlate with cell migration in 3D environments, and cell invasion in 3D is negatively correlated with glioblastoma invasion in vivo. Finally, to best compare across complex model systems, in vivo data, and data from different labs, we suggest that groups report an effect size, a statistical tool that is most translatable across experiments and labs, when conducting experiments that affect cellular motility.

Reducing the foreign body response (FBR) to implanted biomaterials will enhance their in vivo performance in tissue engineering. Poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels are increasingly popular for this application due to their low cost and ease of use. PEG hydrogels can elicit chronic inflammation upon implantation, but recent evidence has suggested that extremely hydrophilic, zwitterionic hydrogels can reduce the FBR to particles and gels. To expand on this approach, we synthesized hydrogels of co-monomers PEG and the zwitterion phosphorylcholine (PC) to quantify the combinatorial effects of modulus and hydrophilicity on the FBR. Surprisingly, hydrogels with the highest amount of zwitterionic co-monomer elicited the highest FBR we observed. Lowering the hydrogel modulus (165 kPa to 3 kPa), or PC content (20 wt% to 0 wt%), mitigated this effect. A high density of macrophages was found at the surface of implants associated with a high FBR, and mass spectrometry analysis of the proteins adsorbed to these gels implicated extracellular matrix, immune response, and cell adhesion protein categories as drivers of macrophage recruitment to these hydrogels. Overall, we show that modulus regulates macrophage adhesion to zwitterionic-PEG hydrogels, and demonstrate that chemical modifications to hydrogels should be studied in parallel with their physical properties to optimize implant design.

Tunable biomaterials that mimic selected features of the extracellular matrix (ECM), such as its stiffness, protein composition, and dimensionality, are increasingly popular for studying how cells sense and respond to ECM cues. In the field, there exists a significant trade-off for how complex and how well these biomaterials represent the in vivo microenvironment, versus how easy they are to make and how adaptable they are to automated fabrication techniques. To address this need to integrate more complex biomaterials design with high-throughput screening approaches, we present several methods to fabricate synthetic biomaterials in 96-well plates and demonstrate that they can be adapted to semi-automated liquid handling robotics. These platforms include 1) glass bottom plates with covalently attached ECM proteins, and 2) hydrogels with tunable stiffness and protein composition with either cells seeded on the surface, or 3) laden within the three-dimensional hydrogel matrix. This study includes proof-of-concept results demonstrating control over breast cancer cell line phenotypes via these ECM cues in a semi-automated fashion. We foresee the use of these methods as a mechanism to bridge the gap between high-throughput cell-matrix screening and engineered ECM-mimicking biomaterials.

Tumors can undergo long periods of dormancy, with cancer cells entering a largely quiescent, non-proliferative state before reactivation and outgrowth. For a patient, these post-remission tumors are often drug resistant and highly aggressive, resulting in poor prognosis. To understand the role of the extracellular matrix (ECM) in regulating tumor dormancy, we created an in vitro cell culture system that combines carefully controlled ECM substrates with nutrient deprivation to observe entrance into and exit from dormancy with live imaging. We saw that cell populations capable of surviving entrance into long-term dormancy were heterogeneous, containing quiescent, cell cycle arrested, and actively proliferating cells. Cell populations that endured extended periods of serum-deprivation-induced dormancy formed an organized, fibrillar fibronectin matrix via αvβ3 and α5β1 integrin adhesion, ROCK-generated tension, and TGFβ2 stimulation. We surmised that the fibronectin matrix was primarily a mediator of cell survival, not proliferation, during the serum-deprivation stress, bacause cancer cell outgrowth after dormancy required MMP-2-mediated fibronectin degradation. Given the difficulty of animal models in observing entrance and exit from dormancy in real-time, we propose this approach as a new, in vitro method to study factors important in regulating dormancy, and we used it here to elucidate a role for fibronectin deposition and MMP activation.

Appropriately chosen descriptive models of cell migration in biomaterials will allow researchers to characterize and ultimately predict the movement of cells in engineered systems for a variety of applications in tissue engineering. The persistent random walk (PRW) model accurately describes cell migration on two-dimensional (2D) substrates. However, this model inherently cannot describe subdiffusive cell movement, i.e. migration paths in which the root mean square displacement increases more slowly than the square root of the time interval. Subdiffusivity is a common characteristic of cells moving in confined environments, such as three-dimensional (3D) porous scaffolds, hydrogel networks, and in vivo tissues. We demonstrate that a generalized anomalous diffusion (AD) model, which uses a simple power law to relate the mean square displacement (MSD) to time, more accurately captures individual cell migration paths across a range of engineered 2D and 3D environments than does the more commonly used PRW model. We used the AD model parameters to distinguish cell movement profiles on substrates with different chemokinetic factors, geometries (2D vs 3D), substrate adhesivities, and compliances. Although the two models performed with equal precision for superdiffusive cells, we suggest a simple AD model, in lieu of PRW, to describe cell trajectories in populations with a significant subdiffusive fraction, such as cells in confined, 3D environments.