Abstract Physiological and pharmacological studies indicate that descending projections from the prefrontal cortex modulate dopaminergic transmission in the nucleus accumbens septi and ventral tegmental area. We investigated the ultrastructural bases for these interactions in rat by examining the synaptic associations between prefrontal cortical terminals labeled with anterograde markers (lesion‐induced degeneration or transport of Phaseolus vulgaris leucoagglutinin; PHA‐L) and neuronal processes containing immunoreactivity for the catecholamine synthesizing enzyme, tryosine hydroxylase. Prefrontal cortical terminals in the nucleus accumbens and ventral tegmental area contained clear, round vesicles and formed primarily asymmetric synapses on spines or small dendrites. In the ventral tegmental area, these terminals also formed asymmetric synapses on large dendrites and a few symmetric axodendritic synapses. In the nucleus accumbens septi , degenerating prefrontal cortical terminals synapsed on spiny dendrites which received convergent input from terminals containing peroxidase immunoreactivity for tyrosine hydroxylase, or from unlabeled terminals. In single sections, some tyrosine hydroxylase‐labeled terminals formed thin and punctate symmetric synapses with dendritic shafts, or the heads and necks of spines. Close appositions, but not axo‐axonic synapses, were frequently observed between degenerating prefrontal cortical afferents and tyrosine hydroxylase‐labeled or unlabeled terminals. In the ventral tegmental area , prefrontal cortical terminals labeled with immunoperoxidase for PHA‐L were in synaptic contact with dendrites containing immunogold reaction product for tyrosine hydroxylase, or with unlabeled dendrites. These results suggest that: (1) catecholaminergic (mainly dopaminergic) and prefrontal cortical terminals in the nucleus accumbens septi dually synapse on common spiny neurons; and (2) dopaminergic neurons in the ventral tegmental area receive monosynaptic input from prefrontal cortical afferents. This study provides the first ultrastructural basis for multiple sites of cellular interaction between prefrontal cortical efferents and mesolimbic dopaminergic neurons.

Abstract The projections of neurons in the nucleus locus coeruleus (LC) of the rat were traced by radioautography following stereotaxic injections of 3 H‐proline. An ascending bundle consisting of a dense cluster of labeled axons accompanied the medial forebrain bundle (MFB) into the lateral hypothalamus. Rostral to the anterior commissure, the labeled fibers contributed to other major pathways: the stria terminalis to the amygdala, and the cingulum bundle and the supracallosal stria to the cingulate cortex, subiculum, and hippocampus. The rest of the ascending fibers terminated diffusely in the pyriform cortex and frontal neocortex. In addition, a lateral group of labeled fibers entered the cerebellum through the superior cerebellar peduncle and terminated around the Purkinje cell somata and in the molecular layer. Descending fibers which entered the medulla either terminated around brainstem nuclei or passed into the ventral portion of the spinal cord. In all areas except the brainstem, the labeling was unilateral with respect to the injection site. This distribution of label from LC provides direct confirmation for connections which have been difficult to visualize in their entirety by any other histological or cytochemical method.

Abstract The immunocytochemical localization of tyrosine hydroxylase is examined at embryonic (E) days 18 and 21 in rat brain in order to determine changes in the distribution and cytology of neurons showing immunoreactivity for the enzyme during late prenatal developmnt. As compared with earlier stages of development, the distribution and morphology of the tyrosine hydroxylasecontaining neurons at E18 and E21 more closely resemble catecholaminergic neurons in the adult brain. The changes occuring from the early to the late prenatal stages of development appear to be the result of an increase in number of cells and continued aggregation and migration of the labeled neurons. The major differences in the distribution of labeled perikarya between E18 and E21 are in the olfactory bulb and cerebral cortex. In the olfactory bulb, tyrosine hydroxylase‐containing neurons are not detected until E21. In contrast in the cerebral cortex, a few neurons are transiently labeled for the enzyme at E18, but are not detected at E21 and have not been reported in the adult brain. The most striking change in the tyrosine‐hydroxylase labeled structures in the late prenatal period is the increase in detectable immunoreactivity in bundles of axons and in terminal aborizations. The orderly appearance of tyrosine hydroxylase‐labeled axons in the neostriatum and cortex are discussed in relation to the formation of these two contrasting regions innervated by catecholaminergic neurons.

Levels of tyrosine hydroxylase (TH) and the ultrastructural relation between axons from cerebral cortex and TH containing, predominantly dopaminergic terminals were examined in the adult rat neostriatum at 2 and 12 days following unilateral decortication. The caudate nuclei from the unlesioned and lesioned hemispheres were biochemically assayed for TH or processed for light or electron microscopic localization of the enzyme. At both time intervals examined, there was no statistically significant alteration in TH activity or apparent change in the intensity of reactive labeling visualized by light microscopy. However, electron microscopic examination of the caudate nucleus homolateral to the decortication at two days following surgery revealed the presence of numerous small, osmiophilic boutons which were much less frequently seen on the contralateral side. Further ultrastructural examination showed that the osmiophilic boutons formed predominately asymmetric, axodendritic synapses. In sections containing both degenerating and TH labeled terminals, two patterns of connectivity could be discovered. First and most commonly, the degenerating and TH-labeled terminals formed synapses with the same dendrite or dendritic spine. Less frequently, the two types of terminals were in direct contact with each other. In this axo-axonic relation, the outer membranes between the terminals were in apposition but usually failed to exhibit pre- or postsynaptic specializations. These findings indicate that the cortical and dopaminergic nigral efferents have actions on common recipient neurons in the rat caudate nucleus and provide support for a possible direct axonal interrelationship between these two primary inputs.

The limited success of immunogold labeling for pre-embedding immunocytochemistry of neuronal antigens is largely attributed to poor penetration of large (5–20 nm) colloidal gold particles. We examined the applicability of using silver intensification of 1 nm colloidal gold particles non-covalently bound to goat anti-rabbit immunoglobulin (1) for single labeling of a rabbit antiserum against the catecholamine synthesizing enzyme, tyrosine hydroxylase (TH), and (2) for immunogold localization of rabbit anti-TH simultaneously with immunoperoxidase labeling of a mouse monoclonal antibody against the opiate peptide, leucine-enkephalin (LE). Vibratome sections were collected from acrolein fixed brains of adult rats. These sections were immunolabeled without use of freeze-thawing or other methods that enhance penetration, but damage ultrastructure. By light microscopy, incubations in the silver intensifier (Intense M, Janssen) for less than 10 min at room temperature resulted in a brownish-red reaction product for TH. This product was virtually indistinguishable from that seen using diaminobenzidine reaction for detection of peroxidase immunoreactivity. Longer incubations produced intense black silver deposits that were more clearly distinguishable from the brown immunoperoxidase labeling. However, by light microscopy, the gold particles seen by electron microscopy were most readily distinguished from peroxidase reaction product with shorter silver intensification periods. The smaller size of gold particles with shorter periods of silver intensification also facilitated evaluation of labeling with respect to subcellular organelles. Detection of the silver product did not appear to be appreciably changed by duration of post-fixation in osmium tetroxide. In dual-labeled sections, perikarya and terminals exhibiting immunogold-silver labeling for TH were distinct from those containing immunoperoxidase labeling for LE. These results (1) define the conditions needed for optimal immunogold-silver labeling of antigens while maintaining the ultrastructural morphology in brain, and (2) establish the necessity for controlled silver intensification for light or electron microscopic differentiation of immunogold-silver and peroxidase reaction products and for optimal subcellular resolution.

Abstract The immunocytochemical localization of the biosynthetic enzymes‐tyrosine hydroxylase (TH), dopamine‐beta‐hydroxylase (DBH), and phen‐ylethanolamine‐N‐methyltransferase (PNMT)‐was used to determine the cytological features and precise neuroanatomical location of catecholami‐nergic neurons in the medulla oblongata of rat. Perikarya labeled with TH were detected in two bilaterally symmetrical columns located in the ventrolateral and dorsomedial medulla. The distribution and the number of neuronal perikarya containing TH were the same as those containing DBH, except in the dorsal motor nucleus of the vagus at the level of the area postrema where the number of neurons immunocytochemically labeled for TH was considerably greater than those labeled for DBH. The detection of perikarya which show immunoreactivity for TH, used in the biosynthesis of dopamine, noradrenaline, and adrenaline, but not DBH, which converts dopamine to noradrenaline, suggests the existence of dopamine‐synthesiz‐ing neurons in the medulla. Perikarya labeled with PNMT, used in the biosynthesis of adrenaline, were localized in more restricted regions corresponding to rostral subsets of the dorsal and ventral groups labeled for TH and DBH. Counts of neurons immunpcytochemically labeled for TH or PNMT were obtained in order to determine the relative ratio of neurons which contain the enzymes necessary for the synthesis of dopamine, noredrenaline, or adrenaline at various levels of the medulla. At the most caudal levels no PNMT labeled neurons were detected. Further rostral, PNMT‐labeled neurons were first detected in the ventrolateral medulla. At the level of the area postrema, the number of PNMT‐labeled neurons in the ventrolateral medulla was approximately half of the number of cells showing immunoreactivity for TH. In contrast, few PNMT‐labeled cells were detected in the dorsomedial medulla at the level of the area postrema compared to many neurons labeled for TH. At rostral medullary levels, in both the ventrolateral and the dorsomedial regions, the number of neurons labeled for TH and PNMT was essentially the same. Thus most, if not all, of the catecholaminergic neurons in the rostral medulla have PNMT, necessary for the synthesis of adrenaline.

Abstract The immunocytochemical localization of tyrosine hydroxylase is examined during ontogeny in the fetal rat brain in order to determine the age of first detection and subsequent cellular localization of the enzyme and the developmental characteristics of the immature catecholaminergic neurons. Fetal atlases of the tyrosine hydroxylase‐labeled neurons are presented at embryonic day (E) 12.5, 13.5, and 14.5. Tyrosine hydroxylase is first detected immunocytochemically at E 12.5. At this stage, the labeled neurons have completed final mitosis, but are still migrating and are cytologically immature. Tyrosine hydroxylase can also be detected in axons and axonal growth cones at this stage of development. The age of first immunocytochemical detection of the enzyme precedes the demonstration of catecholamine fluorescence by 1 to 2 days in certain nuclear groups. At later stages of development (E 13.5 and E 14.5), the major groups of perikarya and processes labeled for tyrosine hydroxylase have a distribution similar to that previously described by catecholamine fluorescence. At E 14.5, the perikarya undergo considerable changes in their cytology and exhibit the first dendrites immunocytochemically labeled for the enzyme. The first terminal fields are also detected in the rudimentary caudate‐putamen at this stage.

The morphology and synaptic associations of dopaminergic axons in the n. caudate-putamen (neostriatum) of the adult rat brain are examined. Identification of dopaminergic axons is based upon the electron microscopic immunocytochemical localization of the catecholamine synthesizing enzyme, tyrosine hydroxylase. Immunoreactivity for the enzyme is detected in unmyelinated axons and axon terminals in serial sections collected throughout the neostriatum. The labeled terminals range from 0.1 to 1.5 micron in diameter and have peroxidase reaction product located around closely packed, round vesicles with a diameter of 40-60 nm. The tyrosine hydroxylase containing axon terminals constitute approximately 21% of the total number of terminals in the n. caudatus-putamen and include 3 types which differ in size and synaptic specializations. The most prevalent (82% of total), type I, is small (0.15-0.39 micron in diameter) and forms symmetric junctions with dendrites and dendritic spines. The other two terminal types (II and III) have a medium to large diameter (0.4-1.5 micron) and show either no membrane specializations or asymmetric junctions with dendrites. The axon terminals without observable membrane densities are occasionally oriented so as to suggest an association with dopaminergic and non-dopaminergic axon terminals. These findings indicate that while the dopaminergic terminals may form axoaxonic connections, the primary synaptic contacts are with dendrites of intrinsic neurons in all regions of n. caudatus-putamen.

The mechanisms subserving the ability of glucocorticoid signaling within the medial prefrontal cortex (mPFC) to terminate stress-induced activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis are not well understood. We report that antagonism of the cannabinoid CB(1) receptor locally within the mPFC prolonged corticosterone secretion following cessation of stress in rats. Mice lacking the CB(1) receptor exhibited a similar prolonged response to stress. Exposure of rats to stress produced an elevation in the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol within the mPFC that was reversed by pretreatment with the glucocorticoid receptor antagonist RU-486 (20 mg/kg). Electron microscopic and electrophysiological data demonstrated the presence of CB(1) receptors in inhibitory-type terminals impinging upon principal neurons within layer V of the prelimbic region of the mPFC. Bath application of corticosterone (100 nm) to prefrontal cortical slices suppressed GABA release onto principal neurons in layer V of the prelimbic region, when examined 1 h later, which was prevented by application of a CB(1) receptor antagonist. Collectively, these data demonstrate that the ability of stress-induced glucocorticoid signaling within mPFC to terminate HPA axis activity is mediated by a local recruitment of endocannabinoid signaling. Endocannabinoid activation of CB(1) receptors decreases GABA release within the mPFC, likely increasing the outflow of the principal neurons of the prelimbic region to contribute to termination of the stress response. These data support a model in which endocannabinoid signaling links glucocorticoid receptor engagement to activation of corticolimbic relays that inhibit corticosterone secretion.