Abstract Engineering enzyme biocatalysts for higher efficiency is key to enabling sustainable, ‘green’ production processes for the chemical and pharmaceutical industry. This challenge can be tackled from two angles: by directed evolution, based on labor-intensive experimental testing of enzyme variant libraries, or by computational methods, where sequence-function data are used to predict biocatalyst improvements. Here, we combine both approaches into a two-week workflow, where ultra-high throughput screening of a library of imine reductases (IREDs) in microfluidic devices provides not only selected ‘hits’, but also long-read sequence data linked to fitness scores of >17 thousand enzyme variants. We demonstrate engineering of an IRED for chiral amine synthesis by mapping functional information in one go, ready to be used for interpretation and extrapolation by protein engineers with the help of machine learning (ML). We calculate position-dependent mutability and combinability scores of mutations and comprehensively illuminate a complex interplay of mutations driven by synergistic, often positively epistatic effects. Interpreted by easy-to-use regression and tree-based ML algorithms designed to suit the evaluation of random whole-gene mutagenesis data, 3-fold improved ‘hits’ obtained from experimental screening are extrapolated further to give up to 23-fold improvements in catalytic rate after testing only a handful of designed mutants. Our campaign is paradigmatic for future enzyme engineering that will rely on access to large sequence-function maps as profiles of the way a biocatalyst responds to mutation. These maps will chart the way to improved function by exploiting the synergy of rapid experimental screening combined with ML evaluation and extrapolation.

ABSTRACT Understanding the effects of rare genetic variants remains challenging, both in coding and non-coding regions. While multiplexed assays of variant effect (MAVEs) have enabled scalable functional assessment of variants, established MAVEs are limited by either exogenous expression of variants or constraints of genome editing. Here, we introduce a pooled prime editing (PE) platform in haploid human cells to scalably assay variants in their endogenous context. We first optimized delivery of variants to HAP1 cells, defining optimal pegRNA designs and establishing a co-selection strategy for improved efficiency. We characterize our platform in the context of negative selection by testing over 7,500 pegRNAs targeting SMARCB1 for editing activity and observing depletion of highly active pegRNAs installing loss-of-function variants. We next assess variants in MLH1 via 6-thioguanine selection, assaying 65.3% of all possible SNVs in a 200-bp region spanning exon 10 and distinguishing LoF variants with high accuracy. Lastly, we assay 362 non-coding MLH1 variants across a 60 kb region in a single experiment, identifying pathogenic variants acting via multiple mechanisms with high specificity. Our analyses detail how filtering for highly active pegRNAs can facilitate both positive and negative selection screens. Accordingly, our platform promises to enable highly scalable functional assessment of human variants.

Abstract Biomechanical cues are instrumental in guiding embryonic development and cell differentiation. Understanding how these physical stimuli translate into transcriptional programs could provide insight into mechanisms underlying mammalian pre-implantation development. Here, we explore this by exerting microenvironmental control over mouse embryonic stem cells (ESCs). Microfluidic encapsulation of ESCs in agarose microgels stabilized the naïve pluripotency network and specifically induced expression of Plakoglobin ( Jup ), a vertebrate homologue of β-catenin. Indeed, overexpression of Plakoglobin was sufficient to fully re-establish the naïve pluripotency gene regulatory network under metastable pluripotency conditions, as confirmed by single-cell transcriptome profiling. Finally, we found that in the epiblast, Plakoglobin was exclusively expressed at the blastocyst stage in human and mouse embryos – further strengthening the link between Plakoglobin and naïve pluripotency in vivo . Our work reveals Plakoglobin as a mechanosensitive regulator of naïve pluripotency and provides a paradigm to interrogate the effects of volumetric confinement on cell-fate transitions. Highlights 3D agarose spheres stabilize the naïve pluripotency network in mouse ESCs. Volumetric confinement induces expression of Plakoglobin, a vertebrate homologue of β-catenin. Plakoglobin expression in the epiblast is specific to pre-implantation human and mouse embryos. Plakoglobin overexpression maintains naïve pluripotency independently of β-catenin.

Abstract Tryptophan synthase catalyzes the synthesis of a wide array of non-canonical amino acids and is an attractive target for directed evolution. Droplet microfluidics offers an ultrahigh throughput approach to directed evolution (>10 7 experiments per day), enabling the search for biocatalysts in wider regions of sequence space with reagent consumption minimized to the picoliter volume (per library member). While the majority of screening campaigns in this format on record relied on an optically active reaction product, a new assay is needed for tryptophan synthase. Tryptophan is not fluorogenic in the visible light spectrum and thus falls outside the scope of conventional droplet microfluidic read-outs which are incompatible with UV light detection at high throughput. Here, we engineer a tryptophan DNA aptamer into a biosensor to quantitatively report on tryptophan production in droplets. The utility of the biosensor was validated by identifying 5-fold improved tryptophan synthases from ∼100,000 protein variants. More generally this work establishes the use of DNA-aptamer sensors with a fluorogenic read-out in widening the scope of droplet microfluidic evolution.