Abstract Methyl-TROSY nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for characterising large biomolecules in solution. However, preparing samples for these experiments is demanding and entails deuteration, limiting its use. Here we demonstrate that NMR spectra recorded on protonated, uniformly 13 C labelled samples can be processed using deep neural networks to yield spectra that are of similar quality to typical deuterated methyl-TROSY spectra, potentially providing information for proteins that cannot be produced in bacterial systems. We validate the methodology experimentally on three proteins with molecular weights in the range 42–360 kDa. We further demonstrate the applicability of our methodology to 3D NOESY spectra of Escherichia coli Malate Synthase G (81 kDa), where observed NOE cross-peaks are in good agreement with the available structure. The method represents an advance in the field of using deep learning to analyse complex magnetic resonance data and could have an impact on the study of large biomolecules in years to come.

Abstract Over the last decade chemical exchange saturation transfer (CEST) NMR methods have emerged as powerful tools to characterize biomolecular conformational dynamics occurring between a visible major state and ‘invisible’ minor states. The ability of the CEST experiment to detect these minor states, and provide precise exchange parameters, hinges on using appropriate B 1 field strengths during the saturation period. Typically, a pair of B 1 fields with ω 1 (= 2 πB 1 ) values around the exchange rate k ex are chosen. Here we show that the transverse relaxation rate of the minor state resonance ( R 2, B ) also plays a crucial role in determining the B 1 fields that lead to the most informative datasets. Using , to guide the choice of B 1 , instead of k ex , leads to data wherefrom substantially more accurate exchange parameters can be derived. The need for higher B 1 fields, guided by K, is demonstrated by studying the conformational exchange in two mutants of the 71 residue FF domain with k ex ∼11 s -1 and ∼72 s -1 , respectively. In both cases analysis of CEST datasets recorded using B 1 field values guided by k ex lead to imprecise exchange parameters, whereas using B 1 values guided by K resulted in precise site-specific exchange parameters. The conclusions presented here will be valuable while using CEST to study slow processes at sites with large intrinsic relaxation rates, including carbonyl sites in small to medium sized proteins, amide 15 N sites in large proteins and when the minor state dips are broadened due to exchange among the minor states.

ABSTRACT Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis and trans proline states, but a full atomistic characterisation of these sub-ensembles is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6 CTR ) from SARS-CoV-2 corresponding to the proline-57 (P57) cis and trans states. We performed MD simulations in three distinct force fields: AMBER03ws, AMBER99SB- disp , and CHARMM36m, which are all optimised for disordered proteins. Each simulation was run for an accumulated time of 180-220 µs until convergence was reached, as assessed by blocking analysis. A good agreement between the cis -P57 populations predicted from metadynamics simulations in AMBER03ws was observed with populations obtained from experimental NMR data. Moreover, we observed good agreement between the radius of gyration predicted from the metadynamics simulations in AMBER03ws and that measured using SAXS. Our findings suggest that both the cis -P57 and trans -P57 conformations of ORF6 CTR are extremely dynamic and that interdisciplinary approaches combining both multi-scale computations and experiments offer avenues to explore highly dynamic states that cannot be reliably characterised by either approach in isolation. SIGNIFICANCE This study employs MD simulations (with metadynamics), NMR spectroscopy, and SAXS to elucidate the individual cis and trans proline conformations of ORF6 CTR from SARS-CoV-2. The good agreement on proline cis / trans populations observed in experiments (NMR) and those calculated from simulations in the AMBER03ws force field (with SAXS reweighting) showcases the efficiency of this interdisciplinary approach, which can be used to characterise highly dynamic disordered protein states, even for very slow processes. Furthermore, our study emphasises the importance of considering both computational and experimental methodologies to gain a more holistic understanding of highly dynamic proteins. The presented integrative approach sets a precedent for future studies aiming to explore complex and dynamic biological systems with slow transitions such as proline isomerisations.

Intrinsically disordered proteins are highly dynamic biomolecules that rapidly interconvert between many structural conformations. Traditionally, these proteins have been considered un-druggable because of their lack of classical long-lived binding pockets. Recent evidence suggests that intrinsically disordered proteins can bind small, drug-like molecules, however, there are limited approaches to characterize these interactions experimentally. Here we demonstrate that ligand-detected 19 F transverse relaxation rates ( R 2 ) obtained from Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy are highly sensitive to the interaction between a small-molecule and an intrinsically disordered protein, in contrast to chemical shift perturbations which are minimally sensitive for this interaction. With this method, we show that the small molecule, 5-fluoroindole, interacts with the disordered domains of non-structural protein 5A from hepatitis C virus with a K d of 260 ± 110 μM. We also demonstrate that 5-fluoroindole remains highly dynamic in the bound form. Our findings suggest that ligand-detected 19 F transverse relaxation measurements could represent a highly effective screening strategy to identify molecules capable of interacting with these traditionally elusive, dynamic biomolecules.

Abstract Most techniques allow detection of protein unfolding either by following the behaviour of single reporters or as an averaged all-or-none process. We recently added 2D NMR spectroscopy to the well-established techniques able to obtain information on the process of unfolding using resonances of residues in the hydrophobic core of a protein. Here, we questioned whether an analysis of the individual stability curves from each resonance could provide additional site-specific information. We used the Yfh1 protein that has the unique feature to undergo both cold and heat denaturation at temperatures above water freezing at low ionic strength. We show that stability curves inconsistent with the average NMR curve from hydrophobic core residues mainly comprise exposed outliers that do nevertheless provide precious information. By monitoring both cold and heat denaturation of individual residues we gain knowledge on the process of cold denaturation and convincingly demonstrate that the two unfolding processes are intrinsically different.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis-proline and trans-proline states, but a full atomistic characterisation of these conformers is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6

Abstract Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has become an important technique in structural biology for characterising the structure, dynamics and interactions of macromolecules. While a plethora of NMR methods are now available to inform on backbone and methyl-bearing side-chains of proteins, a characterisation of aromatic side chains is more challenging and often requires specific labelling or 13 C-detection. Here we present a deep neural network (DNN) named FID-Net-2, which transforms NMR spectra recorded on simple uniformly 13 C labelled samples to yield high-quality 1 H- 13 C correlation spectra of the aromatic side chains. Key to the success of the DNN is the design of a complementary set of NMR experiments that produce spectra with unique features to aid the DNN produce high-resolution aromatic 1 H- 13 C correlation spectra with accurate intensities. The reconstructed spectra can be used for quantitative purposes as FID-Net-2 predicts uncertainties in the resulting spectra. We have validated the new methodology experimentally on protein samples ranging from 7 to 40 kDa in size. We demonstrate that the method can accurately reconstruct high resolution two-dimensional aromatic 1 H- 13 C correlation maps, high resolution three-dimensional aromatic-methyl NOESY spectra to facilitate aromatic 1 H- 13 C assignments, and that the intensities of peaks from the reconstructed aromatic 1 H- 13 C correlation maps can be used to quantitatively characterise the kinetics of protein folding. More generally, we believe that this strategy of devising new NMR experiments specifically for analysis using customised DNNs represents a substantial advance that will have a major impact on the study of molecules using NMR in the years to come.

Despite the tremendous accomplishments of AlpaFold2/3 in predicting biomolecular structure, the protein folding problem remains unsolved in the sense that accurate atomistic models of how protein molecules fold into their native conformations from an unfolded ensemble are still elusive. Here, using chemical exchange saturation transfer (CEST) NMR experiments and a comprehensive four-state kinetic model of the folding trajectory of a 71 residue four-helix bundle FF domain from human HYPA/FBP11 we present an atomic resolution structure of a transiently formed intermediate, I2, that along with the structure of a second intermediate, I1, provides a description of the FF domain folding trajectory. By recording CEST profiles as a function of urea concentration the extent of compaction along the folding pathway is evaluated. Our data establish that unlike the partially disordered I1 state, the I2 intermediate that is also formed before the rate-limiting folding barrier is well ordered and compact like the native conformer, while retaining nonnative interactions similar to those found in I1. The slow-interconversion from I2 to F, involving changes in secondary structure and the breaking of nonnative interactions, proceeds via a compact transition-state. Interestingly, the native state of the FF1 domain from human p190-A Rho GAP resembles the I2 conformation, suggesting that well-ordered folding intermediates can be repurposed by nature in structurally related proteins to assume functional roles. It is anticipated that the strategy for elucidation of sparsely populated and transiently formed structures of intermediates along kinetic pathways described here will be of use in other studies of protein dynamics.

Methyl-TROSY nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for characterising large biomolecules in solution. However, preparing samples for these experiments is arduous and entails deuteration, limiting its use. Here we demonstrate that NMR spectra recorded on protonated, uniformly 13C labelled, samples can be processed using deep neural networks to yield spectra that are of similar quality to typical deuterated methyl-TROSY spectra, potentially providing more information at a fraction of the cost. We validated the new methodology experimentally on three proteins with molecular weights in the range 42-360 kDa and further by analysing deep learning-processed NOESY spectra of MSG (81 kDa), where observed NOE cross-peaks were in good agreement with the available structure. The new method represents a substantial advance in the field of using deep learning to analyse complex magnetic resonance data and could have a major impact on the study of large biomolecules in the years to come.