ABSTRACT Bgee is a database to retrieve and compare gene expression patterns in multiple animal species, produced by integrating multiple data types (RNA-Seq, Affymetrix, in situ hybridization, and EST data). It is based exclusively on curated healthy wild-type expression data (e.g., no gene knock-out, no treatment, no disease), to provide a comparable reference of normal gene expression. Curation includes very large datasets such as GTEx (re-annotation of samples as “healthy” or not) as well as many small ones. Data are integrated and made comparable between species thanks to consistent data annotation and processing, and to calls of presence/absence of expression, along with expression scores. As a result, Bgee is capable of detecting the conditions of expression of any single gene, accommodating any data type and species. Bgee provides several tools for analyses, allowing, e.g., automated comparisons of gene expression patterns within and between species, retrieval of the prefered conditions of expression of any gene, or enrichment analyses of conditions with expression of sets of genes. Bgee release 14.1 includes 29 animal species, and is available at https://bgee.org/ and through its Bioconductor R package BgeeDB.

Abstract The synthetic 17α-ethinylestradiol (EE2) is an estrogenic compound of oral contraceptives and therefore a common pollutant that has been suspected to affect the demography of river-dwelling salmonids. We study a population of European grayling ( Thymallus thymallus ) that suffers from sex ratio distortions. Here we test how ecologically relevant concentrations of EE2 affect sex-specific gene expression around early stages of sex differentiation. We collected gametes from F1s of wild spawners, used them for in vitro fertilizations, and raised the resulting embryos singly under experimentally controlled conditions. Embryos were either exposed to 1ng/L EE2 or sham-exposed. RNA was collected from samples taken 10 days before hatching, at the day of hatching, and towards the end of the yolk-sac stage, to study gene expression and relate it to genetic sex (sdY genotype). We found that EE2 affects gene expression of a very large number of genes especially at the day of hatching. The effects of EE2 on gene expression is strongly sex-specific. At the day of hatching, EE2 affected about twice as many genes in females than in males, and towards the end of the yolk-sac larval stage, EE2 effects were nearly exclusively observed in females. Among the many effects was, for example, a surprising EE2-induced molecular masculinization in the females’ heads. Histological examination of gonadal development of EE2-treated or sham-exposed juveniles during the first 4.5 months after hatching revealed a delaying effect of EE2 on sex differentiation. Because grayling sex determination goes through an all-male stage (a rare case of undifferentiated gonochorism), the rate of EE2-induced sex reversal could not be unequivocally determined during the observational period. However, two EE2-treated genetic males had ovarian tissues at the end of the study. We conclude that common levels of EE2 pollution affect grayling from very early stages on by interfering with male and female gene expression around the onset of sex differentiation, by delaying sex differentiation, and by feminizing some males. Author contribution MRR and CW initiated the project. OS, DM, LW, LMC, and CW sampled the adult fish, did the experimental in vitro fertilizations, and prepared the embryos for experimental rearing in the laboratory. All further manipulations on the embryos and the larvae were done by OS, DM, LW, and LMC. The RNA-seq data were analyzed by OS, JR, and MRR, the histological analyses were done by DM, supervised by SK, the molecular genetic sexing was performed by OS and DM, and EV supervised the EE2 analytics. OS and CW performed the remaining statistical analyses and wrote the first version of the manuscript that was then critically revised by all other authors.

Abstract Glioblastoma (GBM) is the most aggressive form of primary brain tumor, for which effective therapies are urgently needed. Cancer cells are capable of evading clearance by phagocytes such as microglia and monocyte-derived cells through engaging tolerogenic programs. Here, we found that high level of Siglec-9 expression correlates with reduced survival in GBM patients. Using conditional knockouts of Siglec-E, the murine functional homologue of Siglec-9, together with single-cell RNA sequencing, we demonstrated significant pro-phagocytosis effects in microglia and monocyte-derived cells in the absence of Siglec-E. Loss of Siglec-E on monocyte-derived cells enhances antigen cross-presentation and production of pro-inflammatory cytokines, resulting in more efficient T cell priming. This bridging of innate and adaptive responses delays tumor growth and results in prolonged survival. Further, we showed synergistic activity of Siglec-E blockade in combinatorial immunotherapies and demonstrate its translational potential against GBM.

Summary Goblet cells secrete mucin to create a protective mucus layer against invasive bacterial infection and are therefore essential for maintaining intestinal health. However, the molecular pathways that regulate goblet cell function remain largely unknown. Although GPR35 is highly expressed in colonic epithelial cells, its importance in promoting the epithelial barrier is unclear. In this study, we show that epithelial Gpr35 plays a critical role in goblet cell function. In mice, cell type-specific deletion of Gpr35 in epithelial cells but not in macrophages results in goblet cell depletion and dysbiosis, rendering these animals more susceptible to Citrobacter rodentium infection. Mechanistically, scRNA-seq analysis indicates that signaling of epithelial Gpr35 is essential to maintain normal pyroptosis levels in goblet cells. Our work shows that the epithelial presence of Gpr35 is a critical element for the function of goblet cell-mediated symbiosis between host and microbiota.

Abstract Glioblastoma (GBM) harbors a highly immunosuppressive tumor microenvironment (TME) which influences glioma growth. Major efforts have been undertaken to describe the TME on a single-cell level. However, human data on regional differences within the TME remain scarce. Here, we performed high-depth single-cell RNA sequencing (scRNAseq) on paired biopsies from the tumor center, peripheral infiltration zone and blood of five primary GBM patients. Through analysis of > 45’000 cells, we revealed a regionally distinct transcription profile of microglia (MG) and monocyte-derived macrophages (MdMs) and an impaired activation signature in the tumor-peripheral cytotoxic-cell compartment. Comparing tumor-infiltrating CD8 + T cells with circulating cells identified CX3CR1 high and CX3CR1 int CD8 + T cells with effector and memory phenotype, respectively, enriched in blood but absent in the TME. Tumor CD8 + T cells displayed a tissue-resident memory phenotype with dysfunctional features. Our analysis provides a regionally resolved mapping of transcriptional states in GBM-associated leukocytes, serving as an additional asset in the effort towards novel therapeutic strategies to combat this fatal disease.

Abstract RNA-Seq is a powerful technique to provide quantitative information on gene expression. While many applications focus on estimated expression levels, it is also important to determine which genes are actively transcribed, and which are not. The problem can be viewed as simply setting a biologically meaningful threshold for calling a gene expressed. We propose to define this threshold per sample relative to the background level for non-expressed genomic features, inferred by the amount of reads mapped to intergenic regions of the genome. To this aim, we first define a stringent set of reference intergenic regions, based on available bulk RNA-Seq libraries for each species. We provide predefined regions selected for different animal species with varying genome annotation quality through the Bgee database. We then call genes expressed if their level of expression is significantly higher than the background noise. This approach can be applied to bulk as well as single-cell RNA-Seq, on a single library as well as on a combination of libraries over one condition. We show that the estimated proportion of expressed genes is biologically meaningful and stable between libraries originating from the same tissue, in both model and non-model organisms.

CD4 memory T cells play an important role in protective immunity and are a key target in vaccine development. Many studies have focused on T central memory (TCM) cells, while the existence and functional significance of T follicular helper (TFH) memory cells is controversial. Here we show that TFH memory cells are highly susceptible to NAD induced cell death (NICD) during isolation from tissues, leading to their under-representation in prior studies. NICD blockade reveals the persistence of abundant TFH memory cells, with high expression of hallmark TFH markers, that persist to at least 400 days after infection, by which time TCM cells are no longer found. Using single cell RNA-seq we demonstrate that TFH memory cells are transcriptionally distinct from TCM cells, maintain stemness and self-renewal gene expression, and, in contrast to TCM cells, are multipotent following recall. Surprisingly, TFH memory cells concurrently express a distinct glycolytic signature similar to trained immune cells, including elevated expression of mTOR, HIF-1 and cAMP regulated genes. Late disruption of glycolysis/ICOS signaling leads to TFH memory cell depletion concomitant with decreased splenic plasma cells and circulating antibody titers, demonstrating both unique homeostatic regulation of memory TFH and their sustained function during the memory phase of the immune response. These results highlight the metabolic heterogeneity underlying distinct memory T cell subsets and establish TFH memory cells as an attractive target for the induction of long-lived adaptive immunity.HIGHLIGHTS

Abstract Background and aims Previously, we identified immune-suppressive circulating monocytic myeloid-derived suppressor cells (M-MDSC) in patients with cirrhosis and liver failure, which increased with disease severity and were associated with infections and mortality. Impaired immune responses and M-MDSC expansion were reversed by ex vivo polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) treatment. Here, we aimed to investigate hepatic MDSC subsets in liver biopsies of cirrhotic patients and identify MDSC subsets in murine models to assess the safety and efficacy of poly(I:C) in vivo . Methods 22 cirrhotic patients and 4 controls were clinically characterised. MDSC were identified in liver biopsies (immunofluorescence) and in the circulation (flow cytometry). M- MDSC phenotype and function following poly(I:C) stimulation were assessed ex vivo . Carbon tetrachloride-based murine models of liver fibrosis were used. Poly(I:C) was administered therapeutically. MDSC biology was investigated with flow cytometry, immunofluorescence and T-cell proliferation assay. Hepatic histopathology, transcriptomics (BulkRNAseq) and serum markers were assessed. Results Besides circulating M-MDSC, hepatic CD14 + CD84 + M-MDSC and CD15 + CD84 + polymorphonuclear-MDSC expanded in cirrhotic patients and indicated disease severity, infections and poor survival. Poly(I:C) treatment reversed phenotype and function of circulating M-MDSC ex vivo . Circulating and hepatic MDSC expanded in our murine models of liver fibrosis and suppressed T-cell proliferation. Lipopolysaccharide and E.coli challenge exacerbated hepatic MDSC and fibrosis compared to CCl 4 controls. Poly(I:C) therapy reduced MDSC expansion in fibrotic mice with bacterial infection and CCl 4 -induced fibrosis. Conclusion Hepatic MDSC expanded in cirrhotic patients and were linked with disease severity and poor prognosis. Poly(I:C) reversed frequency and function of M-MDSC ex vivo . Poly(I:C) therapy reversed MDSC expansion and fibrosis in a murine model of liver fibrosis with infection. Thus, we highlighted poly(I:C) as a potential immunotherapy for the treatment of immuneparesis in cirrhosis.

Motivation: High-throughput sequencing has transformed the study of gene expression levels through RNA-seq, a technique that is now routinely used by various fields, such as genetic research or diagnostics. The advent of third generation sequencing technologies providing significantly longer reads opens up new possibilities. However, the high error rates common to these technologies set new bioinformatics challenges for the gapped alignment of reads to their genomic origin. In this study, we have explored how currently available RNA-seq splice-aware alignment tools cope with increased read lengths and error rates. All tested tools were initially developed for short NGS reads, but some have claimed support for long PacBio or even ONT MinION reads. Results: The tools were tested on synthetic and real datasets from the PacBio and ONT MinION technologies, and both alignment quality and resource usage were compared across tools. The effect of error correction of long reads was explored, both using self-correction and correction with an external short reads dataset. A tool was developed for evaluating RNA-seq alignment results. This tool can be used to compare the alignment of simulated reads to their genomic origin, or to compare the alignment of real reads to a set of annotated transcripts. Our tests show that while some RNA-seq aligners were unable to cope with long error-prone reads, others produced overall good results. We further show that alignment accuracy can be improved using error-corrected reads.

Abstract Background : Glioblastoma (GBM) is a lethal brain tumor without effective treatment options. The aim of this study was to characterize longitudinal tumor immune microenvironment (iTME) changes in order to find potential actionable targets to prevent GBM-induced immune evasion mechanisms. Methods : This study included 15 patient-matched treatment-naïve WHO grade 4 primary (pGBM) and recurrent (rGBM) tumors. RNA and proteins extracted from fresh frozen tumor samples from matched pGBM and rGBM were profiled via transcriptomics and proteomics, respectively. A tissue microarray containing paired formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples was processed for spatial transcriptomics analysis. Results : Differentially expressed genes and proteins between pGBM and rGBM were involved in pathways responsible for synapse development and myelination which have been shown to play a role in GBM recurrence. By categorizing patients into short and long time-to-relapse (STTR vs LTTR), we identified genes positively or negatively associated with TTR. Expression of Fcγ receptors and complement system genes such as FCGR1A ( CD64 ), FCGR3A and C3 in rGBM samples were negatively correlated with TTR, whereas expression of DNMT1/3A , and SMARCA4 , involved in DNA methylation, were positively correlated with TTR. Spatial transcriptomic analysis of the tumor cell compartment showed enrichment of oligodendrocytes in rGBM, whereas the myeloid cell compartment switched from quiescent to activated microglia, was enriched in B and T cells, specifically in rGBM with STTR. Conclusions: Our results uncover a role for CD64-expressing activated microglia in GBM recurrence and suggest that interfering with these cells may represent a therapeutic option for hindering GBM relapse. Key points: Transcriptomic and proteomic differences exist between patient-paired primary and recurrent GBM tumors High expression of Fcy receptors genes on activated microglia at tumor recurrence is associated with shorter time to relapse. Importance of this study: In glioblastoma (GBM), the tumor recurs in almost all cases after standard treatment such as surgery and chemo-radiotherapy. In this study, we longitudinally evaluated the immune- and neoplastic compartments using transcriptomic, proteomic, and spatial transcriptomics in patient-matched treatment-naive and recurrent tumor samples. By correlating gene expression with time-to-relapse, we identified a geneset associated with treatment resistance and faster tumor recurrence. Moreover, this study highlighted the plasticity of the myeloid compartment during disease progression and an unfavorable role of activated microglia in tumor recurrence.