Abstract The genome sequence assembly of the diploid and highly homozygous V. vinifera genotype PN40024 serves as the reference for many grapevine studies. Despite several improvements of the PN40024 genome assembly, its current version PN12X.v2 is quite fragmented and only represents the haploid state of the genome with mixed haplotypes. In fact, despite the PN40024 genome is nearly homozygous, it still contains various heterozygous regions. Taking the opportunity of the improvements that long-read sequencing technologies offer to fully discriminate haplotype sequences and considering that several Vitis sp. genomes have recently been assembled with these approaches, an improved version of the reference, called PN40024.v4, was generated. Through incorporating long genomic sequencing reads to the assembly, the continuity of the 12X.v2 scaffolds was highly increased. The number of scaffolds decreased from 2,059 to 640 and the number of N bases was reduced by 88%. Additionally, the full alternative haplotype sequence was built for the first time, the chromosome anchoring was improved and the amount of unplaced scaffolds were reduced by half. To obtain a high-quality gene annotation that outperforms previous versions, a liftover approach was complemented with an optimized annotation workflow for Vitis . Integration of the gene reference catalogue and its manual curation have also assisted in improving the annotation, while defining the most reliable estimation to date of 35,230 genes. Finally, we demonstrate that PN40024 resulted from selfings of cv. ‘Helfensteiner’ (cross of cv. ‘Pinot noir’ and ‘Schiava grossa’) instead of a single ‘Pinot noir’. These advances will help maintaining the PN40024 genome as a gold-standard reference also contributing in the eventual elaboration of the grapevine pangenome.

ABSTRACT Gene co-expression networks (GCNs) have not been extensively studied in non-model plants. However, the rapid accumulation of transcriptome datasets in these species represents an opportunity to explore underutilized network aggregation approaches that highlight robust co-expression interactions and improve functional connectivity. We applied and evaluated two different aggregation methods on public grapevine RNA- Seq datasets belonging to three different tissue conditions (leaf, berry and ‘all organs’). Our results show that co-occurrence-based aggregation generally yielded the best-performing networks. We applied GCNs to study several TF gene families, showing its capacity of detecting both already-described and novel regulatory relationships between R2R3-MYBs, bHLH/MYC and multiple secondary metabolism pathway reactions. Specifically, TF gene-and pathway-centered network analyses successfully ascertained the previously established role of VviMYBPA1 in controlling the accumulation of proanthocyanidins while providing insights into its novel role as a regulator of p -coumaroyl-CoA biosynthesis as well as the shikimate and aromatic amino-acid pathways. This network was validated using DNA Affinity Purification Sequencing data, demonstrating that co-expression networks of transcriptional activators can serve as a proxy of gene regulatory networks. This study presents an open repository to reproduce networks and a GCN application within the Vitviz platform, a user-friendly tool for exploring co-expression relationships.

Water tolerance in plants is often associated with the accumulation of osmotic protectants, which are secondary metabolites that can help the plant to cope with water stress. One of the key osmotic protectants is a sugar called Raffinose, which is synthesized by a family of enzymes called Raffinose synthases. In this work, we focused on one of these enzymes, VviRAF2, which is a gene that shows different expression levels and genetic variants (SNPs) among different grapevine cultivars, ranging from tolerant to susceptible to water stress, and the transcription factors that may regulate the expression of this gene family. We analyzed the transcriptome data of these cultivars and constructed a gene co-expression network based on the reference genome, which revealed the involvement of the MYB transcription factor named 'AQUILO'. To test the function of VviRAF2 and 'AQUILO' in water-stress tolerance, we engineered such genes via Agrobacterium tumefaciens using both, transgenic and cisgenic approach: one VviRAF2 under the control of the 35-s promoter, and another with the insertion of AQUILO controlled by its own promoter. During this study, we performed gene expression experiments on transformed lines to compare the DEGs in response to water-stress. Finally, we present the preliminary results related to stress response underlying the pathways of water stress tolerance.

Throughout the growing season, grapevine frequently encounters environmental challenges associated with heat and light radiation stress, especially during the ripening stage, thereby constraining the yield and quality of berries. MYB24 has been previously proposed to control light responses during late fruit ripening stages, and it has been found to require the co-factor MYC2. We have generated transcriptomic data from grapevine leaves transiently co-transformed with MYB24 and MYC2. Differential expression analysis revealed 179 up-regulated genes (URGs). Considering tissue specificity, where MYB24 is specifically and highly expressed in flowers and late-ripening berries, the expression of these URGs was explored using a previously published Berry Development Atlas gathering berry development data of cv. 'Pinot Noir' and 'Cabernet Sauvignon' in different vintages. Half of URGs highly co-express with MYB24, and MapMan analysis discloses many significantly enriched heat-related terms. Specifically, 18 co-expressed URGs were reported as heat-induced genes. Due to the DNA-binding capacity of MYB24 and MYC2, we investigated their regulatory potential by taking advantage of DAP-seq data. More than 40 of these co-expressed URGs, named as MYB24/MYC2 high confidence targets (HCTs), are bound by both TFs or one of them in their 5kb upstream region. In particular, some HCTs have been previously and functionally validated as heat regulators or heat-induced genes. Furthermore, MYB24, MYC2, and a high proportion of their HCTs were significantly induced in reanalyzed heat-treatment transcriptomic studies. To sum up, our data suggests that the MYB24-MYC2 complex plays a key role in the hierarchical regulation of heat responses.

Abstract Grapevine ( Vitis vinifera L.) is the world's third most valuable horticultural crop, and the current environmental scenario is massively shifting the grape cultivation landscape. The increase in heatwaves and drought episodes alter fruit ripening, compromise grape yield and vine survival, intensifying the pressure on using limited water resources. ABA is a key phytohormone that reduces canopy transpiration and helps plants to cope with water deficit. However, the exogenous application of ABA is impractical because it suffers fast catabolism, and UV‐induced isomerization abolishes its bioactivity. Consequently, there is an emerging field for developing molecules that act as ABA receptor agonists and modulate ABA signaling but have a longer half‐life. We have explored the foliar application of the iSB09 and AMF4 agonists in the two grapevine cultivars cv. ‘Bobal’ and ‘Tempranillo’ to induce an ABA‐like response to facilitate plant adaptation to drought. The results indicate that iSB09 and AMF4 act through the VviPYL1‐like, VviPYL4‐like, and VviPYL8‐like ABA receptors to trigger stomatal closure, reduce plant transpiration, and increase water use efficiency. Structural and bioinformatic analysis of VviPYL1 in complex with ABA or these agonists revealed key structural determinants for efficient ligand binding, providing a mechanistic framework to understand receptor activation by the ligands. Physiological analyses further demonstrated that iSB09 has a more sustained effect on reducing transpiration than ABA, and agonist spraying of grapevine leaves protected PSII during drought stress. These findings offer innovative approaches to strengthen the vine's response to water stress and reduce plant consumptive water use under limited soil water conditions.

Abstract The stilbenoid pathway is responsible for the production of resveratrol and its derivatives in grapevine. A few transcription factors (TFs) have been previously identified as regulators of this pathway but the extent of this control is yet to be fully understood. Here we demonstrate how DNA affinity purification sequencing (DAP-Seq) allows for genome-wide TF binding site interrogation in a non-model species. We obtained 5,190 and 4,443 binding events assigned to 4,041 and 3,626 genes for MYB14 and MYB15, respectively (around 40% of peaks being located within -10kb of transcription start sites). DAP-Seq of MYB14 and MYB15 was combined with aggregate gene centred co-expression networks built from more than 1,400 transcriptomic datasets from leaves, fruits and flowers to narrow down bound genes to a set of high confidence targets. The analysis of MYB14, MYB15 and MYB13, a third uncharacterised member of Subgroup 2 (S2), showed that in addition to the few previously known stilbene synthase ( STS ) targets, these three regulators bind to 30 out of 47 STS family genes. Moreover all three MYBs bind to several PAL , C4H and 4CL genes, in addition to shikimate pathway genes, the WRKY03 stilbenoid co-regulator and novel resveratrol-modifying gene candidates amongst which ROMT2 - 3 were validated enzymatically. A high proportion of DAP-Seq bound genes was induced in the activated transcriptomes of transient MYB15 -overexpressing stilbenoid-producing grapevine leaves, validating our methodological approach for identifying gene regulatory networks of specialised metabolism. Overall, MYB genes from Subgroup 2 appear to play a key role in binding and directly regulating several primary and secondary metabolic steps leading to an increased flux towards stilbenoid production.

Abstract Mulberry ( Morus alba L.) is considered a millenary medicinal plant and a food source for silkworms. Different M. alba extracts offer a variety of biological and pharmacological properties that are in part attributed to stilbenoids, a small group of phenylpropanoids that include resveratrol and oxyresveratrol. These are naturally present in non-renewable parts of mulberry trees, impeding their efficient extraction. As a way to bypass this spatiotemporal restriction, we generated cell suspensions from mulberry twigs and demonstrated that the combined use of methyl jasmonate and methyl- or hydroxypropyl-β-cyclodextrins elicited a high production of resveratrol and oxyresveratrol, both intra and extracellularly. To identify oxyresveratrol-producing enzymes (unknown to date), we first improved the structural and functional annotation of the mulberry genome by integrating short and long-read sequencing data. We further combined this data with transcriptome, metabolite and proteome time-series evidence to identify a complete set of elicited phenylpropanoid- and stilbenoid-related genes. These included 22 stilbene synthase ( STS ) genes and a group of six p -coumaroyl-CoA 2’-hydroxylases (C2’Hs) that were highly co-expressed with resveratrol and oxyresveratrol accumulation. We transiently transformed Nicotiana benthamiana plants and grapevine ( Vitis vinifera L.) cell suspensions to functionally validate the role of C2’Hs as the first committed step of oxyresveratrol synthesis, providing an alternative substrate for STSs by hydroxylating p -coumaroyl-coA into 2’4’-dihydroxycinnamoyl-CoA. We offer tools for genomic and transcriptomic exploration in the context of jasmonate elicitation aiding in the characterization of novel stilbenoid-modifying and regulatory genes in the Morus genus.