Abstract With the advent of resistance to existing treatments, new drugs are needed to combat apicomplexan parasites such as the causative agents of malaria ( Plasmodium species) and toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ). To identify new inhibitors of the mitochondrial electron transport chain (ETC) in these parasites, we developed a Seahorse XFe96 flux analyzer approach to screen compounds from the Medicines for Malaria Venture ‘Pathogen Box’ for ETC inhibition. We identified six chemically diverse, on-target inhibitors of the ETC of T. gondii , five of which also target the ETC of Plasmodium falciparum . Two of the identified compounds (MMV024937 and MMV688853) represent novel ETC inhibitor chemotypes. We pinpoint the molecular targets of these inhibitors, demonstrating that all target ETC Complex III, with MMV688853 additionally targeting a kinase with a key role in parasite invasion of host cells. Most of the compounds remain effective inhibitors of parasites that are resistant to the clinically used Complex III inhibitor atovaquone. In sum, we have developed a versatile screening approach to identify and characterize new inhibitors of the ETC in apicomplexan parasites.

Abstract The malaria-causing blood stage of Plasmodium falciparum requires extracellular pantothenate for proliferation. The parasite converts pantothenate into coenzyme A (CoA) via five enzymes, the first being a pantothenate kinase ( Pf PanK). Multiple antiplasmodial pantothenate analogues, including pantothenol and CJ-15,801, kill the parasite by targeting CoA biosynthesis/utilisation. Their mechanism of action, however, remains unknown. Here, we show that parasites pressured with pantothenol or CJ-15,801 become resistant to these analogues. Whole-genome sequencing revealed mutations in one of two putative PanK genes ( Pfpank1 ) in each resistant line. These mutations significantly alter Pf PanK activity, with two conferring a fitness cost, consistent with Pfpank1 coding for a functional PanK that is essential for normal growth. The mutants exhibit a different sensitivity profile to recently-described, potent, antiplasmodial pantothenate analogues, with one line being hypersensitive . We provide evidence consistent with different pantothenate analogue classes having different mechanisms of action: some inhibit CoA biosynthesis while others inhibit CoA-utilising enzymes.

ABSTRACT Coenzyme A is synthesised from pantothenate via five enzyme-mediated steps. The first step is catalysed by pantothenate kinase (PanK). All PanKs characterised to date form homodimers. Many organisms express multiple PanKs. In some cases, these PanKs are not functionally redundant, and some appear to be non-functional. Here, we investigate the PanKs in two pathogenic apicomplexan parasites, Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii . Each of these organisms express two PanK homologues (PanK1 and PanK2). We demonstrate that Pf PanK1 and Pf PanK2 associate, forming a single, functional PanK complex that includes the multi-functional protein, Pf 14-3-3I. Similarly, we demonstrate that Tg PanK1 and Tg PanK2 form a single complex that possesses PanK activity. Both Tg PanK1 and Tg PanK2 are essential for T. gondii proliferation, specifically due to their PanK activity. Our study constitutes the first examples of heteromeric PanK complexes in nature and provides an explanation for the presence of multiple PanKs within certain organisms.

ABSTRACT Cytoskeletal proteins are essential for parasite proliferation, growth, and transmission, and therefore represent promising drug targets. While αβ-tubulin, the molecular building block of microtubules, is an established drug target in a variety of cancers, we still lack substantial knowledge of the biochemistry of parasite tubulins, which would allow us to exploit the structural divergence between parasite and human tubulins. Indeed, mechanistic insights have been limited by the lack of purified, functional parasite tubulin. In this study, we isolated Plasmodium falciparum tubulin that is assembly-competent and shows specific microtubule dynamics in vitro . We further present mechanistic evidence that two compounds selectively interact with parasite over host microtubules and inhibit Plasmodium microtubule polymerization at substoichiometric compound concentrations. The ability of compounds to selectively disrupt protozoan microtubule growth without affecting human microtubules provides the exciting possibility for the targeted development of novel antimalarials.

The riboflavin analogues, roseoflavin and 8-aminoriboflavin, inhibit malaria parasite proliferation by targeting riboflavin utilization. To determine their mechanism of action, we generated roseoflavin-resistant parasites by in vitro evolution. Relative to wild-type, these parasites were 4-fold resistant to roseoflavin and cross-resistant to 8-aminoriboflavin. Whole genome sequencing of the resistant parasites revealed a missense mutation leading to an amino acid change (L672H) in the gene coding for a putative flavokinase (

Abstract The ability of the human malaria parasite Plasmodium falciparum to access and utilise vital nutrients is critical to its growth and proliferation. Molecules that interfere with these process could potentially serve as antimalarials. We found that two riboflavin analogues, roseoflavin and 8-aminoriboflavin, inhibit malaria parasite proliferation by targeting riboflavin metabolism and/or the utilisation of the riboflavin metabolites flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide. An additional eight riboflavin analogues were evaluated, but none were found to be more potent than roseoflavin, nor was their activity on target. Focussing on roseoflavin, we tested its antimalarial activity in vivo against Plasmodium vinckei vinckei in mice. We found that roseoflavin decreased the parasitemia by 46-fold following a 4 day suppression test and, on average, increased the survival of mice by 4-5 days. Our data are consistent with riboflavin metabolism and/or the utilisation of riboflavin-derived cofactors being viable drug targets for the development of new antimalarials and that roseoflavin could serve as a potential starting point.

ABSTRACT The Plasmodium parasites that cause malaria are adept at developing resistance to antimalarial drugs, necessitating the search for new antiplasmodials. Although several amide analogs of pantothenate (pantothenamides) show potent antiplasmodial activity, hydrolysis by pantetheinases (or vanins) present in blood rapidly inactivates them. We report herein the facile synthesis and biological activity of a small library of pantothenamide analogs in which the labile amide group is replaced with a variety of heteroaromatic rings. Several of the new analogs display antiplasmodial activity in the nanomolar range against P. falciparum and/or P. knowlesi in the presence of pantetheinase. A previously reported triazole and an isoxazole derivative presented here were further characterized and found to possess high selectivity indices, medium or high Caco-2 permeability, and medium or low microsomal clearance in vitro . Although we show here that the two compounds fail to suppress proliferation of P. berghei in vivo , pharmacokinetic and contact time data presented provide a benchmark for the compound profile required to achieve antiplasmodial activity in mice and should facilitate lead optimization.

Abstract We previously found that two riboflavin analogues, roseoflavin and 8-aminoriboflavin, inhibit malaria parasite proliferation by targeting riboflavin utilisation. To determine the mechanism of action of roseoflavin in P. falciparum , we generated roseoflavin-resistant parasites by in vitro evolution over 27 weeks. The roseoflavin-resistant parasites were found to be four times more resistant to roseoflavin and cross-resistant to 8-aminoriboflavin. Resistant parasites were subjected to whole genome sequencing and a missense mutation (T2015A), leading to an amino acid exchange (L672H), was detected in the gene coding for a putative flavokinase ( Pf FK), the enzyme responsible for converting riboflavin (vitamin B 2 ) into the cofactor flavin mononucleotide (FMN). To confirm that the L672H mutation is responsible for the observed phenotype, we generated parasites with the missense mutation incorporated into the Pf FK gene via a single-crossover recombination. The IC 50 values for roseoflavin (RoF) and 8-aminoriboflavin against the RoF-resistant parasites created through in vitro evolution were indistinguishable from the IC 50 values for parasites in which the missense mutation was specifically introduced into the native Pf FK. To investigate this mutation, we generated two parasite lines episomally-expressing GFP-tagged versions of either the wild type or mutant forms of flavokinase. We found that Pf FK-GFP localises to the parasite cytosol and that immunopurified Pf FK-GFP was active and phosphorylated riboflavin into flavin mononucleotide. The L672H mutation caused a reduction of the binding affinity, especially for the substrate RoF, which explains the resistance phenotype. The mutant Pf FK is no longer capable of phosphorylating 8-aminoriboflavin, but its antiplasmodial activity against resistant parasites can still be antagonised by increasing the extracellular concentration of riboflavin, consistent with the compound also inhibiting parasite growth through competitive inhibition of Pf FK. Our findings, therefore are consistent with roseoflavin and 8-aminoriboflavin inhibiting parasite growth by inhibiting FMN production, in addition to the generation of toxic flavin cofactor analogues.