Abstract Automated quantification of behavior is increasingly prevalent in neuroscience research. Human judgments can influence machine-learning-based behavior classification at multiple steps in the process, for both supervised and unsupervised approaches. Such steps include the design of the algorithm for machine learning, the methods used for animal tracking, the choice of training images, and the benchmarking of classification outcomes. However, how these design choices contribute to the interpretation of automated behavioral classifications has not been extensively characterized. Here, we quantify the effects of experimenter choices on the outputs of automated classifiers of Drosophila social behaviors. Drosophila behaviors contain a considerable degree of variability, which was reflected in the confidence levels associated with both human and computer classifications. We found that a diversity of sex combinations and tracking features was important for robust performance of the automated classifiers. In particular, features concerning the relative position of flies contained useful information for training a machine-learning algorithm. These observations shed light on the importance of human influence on tracking algorithms, the selection of training images, and the quality of annotated sample images used to benchmark the performance of a classifier (the ‘ground truth’). Evaluation of these factors is necessary for researchers to accurately interpret behavioral data quantified by a machine-learning algorithm and to further improve automated classifications. Significance Statement Accurate quantification of animal behaviors is fundamental to neuroscience. Here, we quantitatively assess how human choices influence the performance of automated classifiers trained by a machine-learning algorithm. We found that human decisions about the computational tracking method, the training images, and the images used for performance evaluation impact both the classifier outputs and how human observers interpret the results. These factors are sometimes overlooked but are critical, especially because animal behavior is itself inherently variable. Automated quantification of animal behavior is becoming increasingly prevalent: our results provide a model for bridging the gap between traditional human annotations and computer-based annotations. Systematic assessment of human choices is important for developing behavior classifiers that perform robustly in a variety of experimental conditions.

Abstract Somatosensory neurons (SSNs) that detect and transduce mechanical, thermal, and chemical stimuli densely innervate an animal’s skin. However, despite the fact that epidermal cells provide the first point of contact for sensory stimuli. our understanding of roles that epidermal cells play in SSN function, particularly nociception, remains limited. Here, we show that stimulating Drosophila epidermal cells elicits activation of SSNs including nociceptors and triggers a variety of behavior outputs, including avoidance and escape. Further, we find that epidermal cells are intrinsically mechanosensitive and that epidermal mechanically evoked calcium responses require the store-operated calcium channel Orai. Epidermal cell stimulation augments larval responses to acute nociceptive stimuli and promotes prolonged hypersensitivity to subsequent mechanical stimuli. Hence, epidermal cells are key determinants of nociceptive sensitivity and sensitization, acting as primary sensors of noxious stimuli that tune nociceptor output and drive protective behaviors.

ABSTRACT Drosophila serves as a highly valuable model organism across numerous fields including genetics, immunology, neuroscience, cancer biology, and developmental biology. Central to Drosophila -based biological research is the ability to perform comprehensive genetic or chemical screens. However, this research is often limited by its dependence on laborious manual handling and analysis, making it prone to human error and difficult to discern statistically significant or rare events amid the noise of individual variations resulting from genetic and environmental factors. In this article we present flow zoometry, a whole-animal equivalent of flow cytometry for large-scale, individual-level, high-content screening of Drosophila . Our flow zoometer automatically clears the tissues of Drosophila melanogaster , captures three-dimensional (3D) multi-color fluorescence tomograms of single flies with single-cell volumetric resolution at an unprecedented throughput of over 1,000 animals within 48 hours (24 hr for clearing; 24 hr for imaging), and performs AI-enhanced data-driven analysis – a task that would traditionally take months or years with manual techniques. To demonstrate its broad applications, we employed the flow zoometer in various laborious screening assays, including those in toxicology, genotyping, and tumor screening. Flow zoometry represents a pivotal evolution in high-throughput screening technology: previously from molecules to cells, now from cells to whole animals. This advancement serves as a foundational platform for “statistical spatial biology”, to improve empirical precision and enable serendipitous discoveries across various fields of biology.

Aggression is an ethologically important social behavior 1 but excessive aggression can be detrimental to animal fitness 2,3 . Social experiences among conspecific individuals reduce aggression in a wide range of animals 4 . However, the genetic and neural basis for the experience-dependent suppression of aggression remains largely unknown. Here we found that nervy ( nvy ), a Drosophila homolog of vertebrate myeloid translocation gene (MTG) 5 involved in transcriptional regulation 6–8 , suppresses aggression via its action in a specific subset of neurons. Loss-of-function mutation of the nvy gene resulted in hyper-aggressiveness only in socially experienced flies, whereas overexpression of nvy suppressed spontaneous aggression in socially naïve flies. The loss-of-function nvy mutant exhibited persistent aggression under various contexts in which wild-type flies transition to escape or courtship behaviors. Knockdown of nvy in octopaminergic/tyraminergic (OA/TA) neurons increased aggression, phenocopying the nvy mutation. We found that a subpopulation of OA/TA cells specifically labeled by nvy is required for the social-experience-dependent suppression of aggression. Moreover, cell-type-specific transcriptomics on nvy -expressing OA/TA neurons revealed aggression-controlling genes that are likely downstream of nvy . Our results are the first to describe the presence of a specific neuronal subpopulation in the central brain that actively suppresses aggression in a social-experience-dependent manner, illuminating the underlying genetic mechanism.