Abstract Phosphate (Pi) is a pivotal nutrient that constraints plant development and productivity in natural ecosystems. Land colonization by plants, more than 470 million years ago, evolved adaptive mechanisms to conquer Pi-scarce environments. However, little is known about the molecular basis underlying such adaptations at early branches of plant phylogeny. To shed light on how early divergent plants respond to Pi limitation, we analyzed the morpho-physiological and transcriptional dynamics of Marchantia polymorpha upon Pi starvation. Our phylogenomic analysis highlights some gene networks present since the Chlorophytes and others established in the Streptophytes (eg. PHR1-SPX1 and STOP1-ALMT1, respectively). At the morpho-physiological level, the response is characterized by the induction of phosphatase activity, media acidification, accumulation of auronidins, reduction of internal Pi concentration and developmental modifications of rhizoids. The transcriptional response involves the induction of Mp PHR1 , Pi transporters, lipid turnover enzymes and Mp MYB14 , an essential transcription factor for auronidins biosynthesis. Mp STOP2 up-regulation correlates with expression changes in genes related to organic acid biosynthesis and transport, suggesting preference for citrate exudation. Analysis of MpPHR1 binding sequences (P1BS) shows enrichment of this cis regulatory element in differentially expressed genes. Our study unravels the strategies, at diverse levels of organization, exerted by M. polymorpha to cope with low Pi availability. Significance Statement This study unravels the transcriptional and morphophysiological mechanisms executed by the non-vascular, and rootless, plant Marchantia polymorpha upon phosphate starvation conditions. The findings in this study shed light on the mechanisms that early land plants may have developed for the conquest of substrates poor in available phosphate, some of which are still conserved by current-day plants. Moreover, our results open several working hypotheses and novel perspectives for the study of Pi-starvation responses along plant evolution.

Abstract KARRIKIN INSENSITIVE2 (KAI2) was first identified in Arabidopsis thaliana as a receptor of karrikin, a smoke-derived germination stimulant. KAI2 is also considered a receptor of an unidentified endogenous molecule called the KAI2-ligand (KL). Upon KAI2 activation, signals are transmitted through degradation of D53/SMXL proteins via ubiquitination by a Skp-Cullin-F-box (SCF) E3 ubiquitin ligase complex. All components in the KL signaling pathway exist in the liverwort Marchantia polymorpha , namely Mp KAI2A and Mp KAI2B , Mp MAX2 encoding the F-box protein, and Mp SMXL , indicating that the signaling pathway became functional in the common ancestor of bryophytes and seed plants. Genetic analysis using knock-out mutants of these KL signaling genes, produced using the CRISPR system, indicated that Mp KAI2A , Mp MAX2 and Mp SMXL act in the same genetic pathway and control early gemma growth. Introduction of Mp SMXL d53 , in which a domain required for degradation is mutated, into wild-type plants caused phenotypes resembling those of the Mp kai2a and Mp max2 mutants. In addition, Citrine fluorescence was detected in tobacco cells transiently transformed with the 35S :Mp SMXL - Citrine gene construct and treated with MG132, a proteasome inhibitor. On the other hand, introduction of 35S :Mp SMXL d53 - Citrine conferred Citrine fluorescence without MG132 treatment. These findings imply that MpSMXL is subjected to degradation, and that degradation of MpSMXL is crucial for KL signaling in M. polymorpha . We also showed that MpSMXL is negatively regulated by KL signaling. Taken together, this study demonstrates that basic mechanisms in the KL signaling pathway are conserved in M. polymorpha .

ABSTRACT The formation of an organized body requires the establishment and maintenance of cells with structural and functional distinctive characteristics. A central question in developmental biology is how changes in the regulation of genes drive cell specification and patterning 1 . microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate development through mRNA cleavage and/or translational repression 2 . In plants, miRNAs regulate key aspects including growth, development, stem cell maintenance, vegetative phase change, leaf morphogenesis, floral organ formation and flowering time 3 . Biogenesis of plant miRNAs depends on the activity of DICER-LIKE 1 (DCL1), an RNase type III endonuclease that processes double stranded RNA to give rise to mature miRNAs 4 . The genomes of today’s flora contain at least one bona fide copy of DCL1 5,6 . Using Marchantia polymorpha -a model bryophyte that allows comparative approaches to infer characteristics of the ancestral land plant-, we demonstrate that Mp DCL1a is required for the biogenesis of miRNAs and uncovered a central role for miR166/Homeodomain Zipper Class III-regulated auxin synthesis in the specification of cell identity, patterning, meristem function, laminar expansion and the development of the body in the last common ancestor of extant land plants.

Land plant shoot structures evolved a diversity of lateral organs as morphological adaptations to the terrestrial environment, in which lateral organs independently evolved in each lineage in the sporophyte or gametophyte generation. The gametophyte meristem of the basally-diverging plant Marchantia polymorpha produces axes with non-photosynthetic scale-like lateral organs instead of leaves. Here we report that an ALOG ( A rabidopsis L SH1 and O ryza G 1) family protein in Marchantia, MpTAWAWA1 (MpTAW1), regulates meristem maintenance and lateral organ development. A mutation in Mp TAW1 , preferentially expressed in lateral organs, induces lateral organs with mis-specified identity and increased cell number, and furthermore, causes defects in apical meristem maintenance. Remarkably, Mp TAW1 expression rescued the elongated-spikelet phenotype of a rice mutant of Mp TAW1 homologue. This suggests that ALOG genes are co-opted to specify lateral organ identities in both gametophyte and sporophyte shoots by repressing lateral organ growth. We propose that the recruitment of ALOG-mediated lateral organ modification was in part responsible for the convergent evolution of independently-evolved lateral organs among highly divergent plant lineages and contributed to the morphological diversification of land plants.

Rho/Rac of plant (ROP) GTPases are a plant-specific subfamily of Rho small GTP-binding proteins that function as molecular switches by being converted to the active state by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and to the inactive state by GTPase-activating proteins (GAPs). The bryophyte Marchantia polymorpha contains single-copy genes encoding ROP (MpROP), two types of GEFs (ROPGEF and SPIKE(SPK)), and two types of GAPs (ROPGAP and ROP enhancer (REN)). MpROP regulates the development of various organs, including the air chambers, rhizoids, and clonal propagule gemmae. While the sole PRONE-type ROPGEF, KARAPPO (MpKAR), plays an essential role in gemma initiation, little is known about the in-planta functions of other ROP regulatory factors in M. polymorpha . In this study, we focused on the functions of two types of GAPs: MpROPGAP and MpREN. Loss-of-function Mprenge single mutants showed pleiotropic defects in thallus growth, air chamber formation, rhizoid tip growth, and gemma development, whereas MpROPGAP mutants showed no detectable abnormalities. Despite the distinctive domain structures of MpROPGAP and MpREN, Mpropgapge Mprenge double mutants showed more severe phenotypes than the Mprenge single mutants, suggesting redundant functions of MpROPGAP and MpREN in gametophyte organogenesis. Interestingly, overexpression of MpROPGAP, MpREN, and dominant-negative MpROP (MpROPDN) resulted in similar air chamber defects, as well as loss-of-function of MpREN and MpROPGAP and overexpression of constitutively active MpROP (MpROPCA), suggesting importance of activation/inactivation cycling (or balancing) of MpROP. Furthermore, we proved the contributions of the sole DOCK family GEF, MpSPK, to MpROP-regulated air chamber formation. In summary, our results demonstrate a significant role of the two GAPs in the development of various organs and that the two GEFs are responsible for organogenesis through the control of the MpROP active/inactive cycle in the vegetative growth of M. polymorpha .

Summary Dormancy is a key process employed by land plants to adapt to harsh terrestrial environments. The liverwort Marchantia polymorpha produces dormant propagules called gemmae for asexual reproduction. The plant hormone abscisic acid (ABA) plays important roles in regulating dormancy in both the seeds of flowering plants and the gemmae of M. polymorpha . Based on previous transcriptome analysis, we identified the basic helix-loop-helix transcription factor MpHYPNOS (MpHYP) as a key regulator of gemma dormancy. Knock-out mutants of MpHYP showed much higher germination rates of gemmae in gemma cups than ABA-related mutants, while the growth and development of these mutants resembled that of the wild type. Transient induction of MpHYP caused irreversible growth arrest of gemmae and thalli. Transcriptome and RT-qPCR analyses revealed that MpHYP represses the expression of cell cycle–related genes and induces ABA biosynthesis and ABA-responsive genes. Indeed, ABA levels increased in MpHYP overexpression lines and decreased in Mphyp knock-out lines. However, the growth arrest caused by MpHYP overexpression was not suppressed by a mutation in an ABA receptor gene. These findings suggest that MpHYP regulates gemma dormancy and thallus growth mainly through the ABA-independent pathway, providing clues about ABA-dependent and independent regulation of dormancy in land plants.

A variety of plants in diverse taxa can reproduce asexually via vegetative propagation, in which clonal propagules with new meristem(s) are generated directly from vegetative organs. A basal land plant, Marchantia polymorpha, develops clonal propagules, gemmae, in a specialized receptacle, gemma cup. Here we report an R2R3-MYB transcription factor, designated GEMMA CUP-ASSOCIATED MYB 1 (GCAM1), which is an essential regulator of gemma cup development in M. polymorpha. Although gemma cups are a characteristic gametophyte organ for vegetative reproduction in a taxonomically restricted group of liverwort species, phylogenetic and interspecific complementation analyses supported the orthologous relationship of GCAM1 to regulatory factors for axillary meristem formation, e.g. Arabidopsis RAXs and tomato Blind, in angiosperm sporophytes. The present findings in M. polymorpha suggest an ancient acquisition of a regulatory mechanism for production of secondary meristems, and the use of the mechanism for diverse developmental programs during land plant evolution.

(1) the research conducted, including the rationale: Phosphorus (P) is an essential macronutrient for plant growth. In deciduous trees, P is remobilized from senescing leaves and stored in perennial tissues during winter for further growth. To clarify how deciduous trees utilize the internal P through a year, seasonal re-translocation routes and the reuse of P over winter were investigated. (2) methods: We analyzed the seasonal re-translocation and accumulation of P in poplar trees ( Populus alba . L) cultivated under 'a shortened annual cycle system', which mimicked seasonal phenology in a laboratory. The real-time radioisotope imaging and the macro- and micro-autoradiography with 32P and 33P were used to reveal the organ and tissue level P allocation. (3) key results: The direction of phosphate re-translocation changed seasonally. In the growing season, P was mainly re-translocated from a leaf to upper parts via phloem. During senescence, P was re-translocated to lower perennial parts, and also to inner xylem parenchyma cells. Phloem-xylem exchange of re-translocated P occurred in the stem. After bud burst in spring, stored P was re-translocated to the whole plant and mainly accumulated in new shoots. (4) the main conclusion, including the key points of discussion: Poplar trees change the routes of P re-translocation longitudinally and radially depending on the season, and recycle internal P throughout the year.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Many plants can reproduce vegetatively, producing clonal progeny from vegetative cells; however, little is known about the molecular mechanisms underlying this process. Liverwort (Marchantia polymorpha), a basal land plant, propagates asexually via gemmae, which are clonal plantlets formed in gemma cups on the dorsal side of the vegetative thallus. The initial stage of gemma development involves elongation and asymmetric divisions of a specific type of epidermal cell, called a gemma initial, which forms on the floor of the gemma cup. To investigate the regulatory mechanism underlying gemma development, we focused on two allelic mutants in which no gemma initial formed; these mutants were named karappo, meaning 'empty'. We used whole-genome sequencing of both mutants, and molecular genetic analyses to identify the causal gene, KARAPPO (KAR), which encodes a Rop guanine nucleotide exchange factor (RopGEF) carrying a PRONE catalytic domain. In vitro GEF assays showed that the full-length KAR protein and the PRONE domain have significant GEF activity toward MpRop, the only Rop GTPase in M. polymorpha. Moreover, genetic complementation experiments showed a significant role for the N- and C-terminal variable regions in gemma development. Our investigation demonstrated an essential role for KAR/RopGEF in the initiation of plantlet development from a differentiated cell, which may involve cell polarity formation and subsequent asymmetric cell division via activation of Rop signaling, implying a similar developmental mechanism in vegetative reproduction of various land plants.