Abstract Background Identification of de novo mutations from cell populations requires single-cell whole-genome sequencing (SCWGS). Although many experimental protocols of SCWGS have been developed, few computational tools are available for downstream analysis of different types of somatic mutations, including copy number variation (CNV). Results We developed SCCNV, a software tool for detecting CNVs from whole genome-amplified single cells. SCCNV is a read-depth based approach with adjustment for the whole-genome amplification bias. Conclusions We demonstrate its performance by analyzing data collected from most of the single-cell amplification methods, including DOP-PCR, MDA, MALBAC and LIANTI. SCCNV is freely available at https://github.com/biosinodx/SCCNV .

S ummary Somatic mutations accumulate in multiple organs and tissues during aging and are a known cause of cancer. Here we tested whether mutations accumulate during replicative senescence. Cellular senescence is also a possible cause of functional decline in aging, yet also acts as an anti-cancer mechanism in vivo . Using single-cell whole-genome sequencing, we compared mutation burdens between early passage and deeply senescent human fibroblasts. The results showed that single-nucleotide variations and small insertions and deletions increased in senescent cells by about two-fold, but have the same spectrum as early passage cells, while it has been known that particular mutational signatures are found in tumor cells. In contrast, aneuploidies were observed in half the senescent cells, but largely absent in early passage cells. Thus, the patterns of mutations among senescent, normal-aged and tumor cells differ significantly.

Activation of retrotransposons and their insertions into new genomic locations, i.e., retrotranspositions (RTs), have been identified in about 50% of tumors. However, the landscape of RTs in different, normal somatic cell types in humans remains largely unknown. Using single-cell whole-genome sequencing we identified 528 RT events, including LINE-1 (L1), and Alu, in 164 single cells and clones of fibroblasts, neurons, B lymphocytes, hepatocytes and liver stem cells, of 29 healthy human subjects aged from 0 to 106 years. The frequency of RTs was found to vary from <1 on average per cell in primary fibroblasts to 7.8 per cell in hepatocytes. Somewhat surprisingly, RT frequency does not increase with age, which is in contrast to other types of spontaneous mutation. RTs were found significantly more likely to insert in or close to target genes of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), which represses most of the genes encoding developmental regulators through H3K27me3 histone modification in embryonic stem cells. Indeed, when directly comparing RT frequency between differentiated liver hepatocytes with liver stem cells, the latter were almost devoid of RTs. These results indicate that spontaneous RTs are associated with cellular differentiation and occur, possibly, as a consequence of the transient chromatin transition of differentiation-specific genes from a transcriptionally repressed to activated state during the differentiation process.

Summary Substantial numbers of somatic mutations have been found to accumulate with age in different human tissues. Clonal cellular amplification of some of these mutations can cause cancer and other diseases. However, it is as yet unclear if and to what extent an increased burden of random mutations can affect cellular function without clonal amplification. We tested this in cell culture, which avoids the limitation that an increased mutation burden in vivo typically leads to cancer. We performed single-cell whole-genome sequencing of primary fibroblasts from DNA mismatch repair (MMR) deficient Msh2 -/- mice and littermate control animals after long-term passaging. Apart from analyzing somatic mutation burden we analyzed clonality, mutational signatures, and hotspots in the genome, characterizing the complete landscape of somatic mutagenesis in normal and MMR-deficient mouse primary fibroblasts during passaging. While growth rate of Msh2 -/- fibroblasts was not significantly different from the controls, the number of de novo single-nucleotide variants (SNVs) increased linearly up until at least 30,000 SNVs per cell, with the frequency of small insertions and deletions (INDELs) plateauing in the Msh2 -/- fibroblasts to about 10,000 INDELS per cell. We provide evidence for negative selection and large-scale mutation-driven population changes, including significant clonal expansion of preexisting mutations and widespread cell-strain-specific hotspots. Overall, our results provide evidence that increased somatic mutation burden drives significant cell evolutionary changes in a dynamic cell culture system without significant effects on growth. Since similar selection processes against mutations preventing organ and tissue dysfunction during aging are difficult to envision, these results suggest that increased somatic mutation burden can play a causal role in aging and diseases other than cancer.

ABSTRACT The six subunit Origin Recognition Complex (ORC) is essential for loading MCM2-7 at origins of DNA replication to promote initiation of DNA replication in organisms ranging from S. cerevisiae to humans. In rare instances, as in cancer cell-lines in culture with mutations in ORC1 , ORC2 or ORC5 , or in endo-reduplicating mouse hepatocytes in vivo without ORC1 , DNA replication has been observed in the virtual absence of individual ORC subunits. Although ORC1 is dispensable in the mouse liver for endo-reduplication, because of the homology of ORC1 with CDC6, it could be argued that CDC6 was substituting for ORC1 to restore functional ORC. Here, we have created mice with a conditional deletion of ORC2 , to demonstrate that mouse embryo fibroblasts require ORC2 for proliferation, but that the mouse hepatocytes can carry out DNA synthesis in vitro and endo-reduplicate in vivo , despite the deletion of ORC2 . Combining the conditional mutation of ORC1 and ORC2 revealed that the mouse liver can still carry out endo-reduplication despite the deletion of the two genes, both during normal development and after partial hepatectomy. Since endo-reduplication, like normal S phase replication, requires the presence of MCM2-7 on the chromatin, these results suggest that in primary hepatocytes there is a mechanism to load sufficient MCM2-7 to carry out effective DNA replication despite the virtual absence of two subunits of ORC.

Abstract Background The impact of acrylamide (ACR) on learning and memory has garnered considerable attention. However, the targets and mechanisms are still unclear. Results Elongation factor 2 (eEF2) was significantly upregulated in the results of serum proteomics. Results from in vitro and in vivo experiments indicated a notable upregulation of Eukaryotic elongation factor 2 kinase (eEF2K), the sole kinase responsible for eEF2 phosphorylation, following exposure to ACR ( P < 0.05). Subsequent in vitro experiments using eEF2K siRNA and in vivo experiments with eEF2K-knockout mice demonstrated significant improvements in abnormal indicators related to ACR-induced learning and memory deficits ( P < 0.05). Proteomic analysis of the hippocampus revealed Lpcat1 as a crucial downstream protein regulated by eEF2K. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses indicated that eEF2K may play a role in the process of ACR-induced learning and memory impairment by affecting ether lipid metabolism. Conclusions In summary, eEF2K as a pivotal treatment target in the mechanisms underlying ACR-induced learning and memory impairment, and studies have shown that it provides robust evidence for potential clinical interventions targeting ACR-induced impairments.

DNA Mismatch repair (MMR) deficiency is a major cause of hereditary non-polyposis colorectal cancer, and is also associated with increased risk of several other cancers. This is generally ascribed to the role of MMR in avoiding mutations by correcting DNA replication errors. In MMR knockout mice very high frequencies of somatic mutations, up until 100-fold of background, have been reported. However, these results have been obtained using bacterial reporter transgenes, which are not representative for the genome overall, and mutational patterns of MMR deficiency remain largely unknown. To fill this knowledge gap, we performed single-cell whole-genome sequencing of lung fibroblasts of Msh2-/- and wild-type mice. We observed a 4-fold increase of somatic single nucleotide variants (SNVs) in the fibroblasts of Msh2-/- mice compared to those of wild-type mice. The SNV signature of Msh2 deficiency was found to be driven by C>T and T>C transitions. By comparing it to human cancer signatures, we not only confirmed the inferred MMR-deficiency-related etiology of several cancer signatures but also suggested that MMR deficiency is likely the cause of a cancer signature with its etiology previously unknown. We also observed a 7-fold increase of somatic small insertions and deletions (INDELs) in the Msh2-/- mice. An elevated INDEL frequency has also been found in human MMR-related cancers. INDELs and SNVs distributed differently across genomic features in the Msh2-/- and control cells, with evidence of selection pressure and repair preference. These results provide insights into the landscape of somatic mutations in normal somatic cells caused by MMR deficiency.