Abstract Identifying chemical regulators of biological pathways is a time-consuming bottleneck in developing therapeutics and research compounds. Typically, thousands to millions of candidate small molecules are tested in target-based biochemical screens or phenotypic cell-based screens, both expensive experiments customized to each disease. Here, our uncustomized, virtual profile-based screening approach instead identifies compounds that match to pathways based on phenotypic information in public cell image data, created using the Cell Painting assay. Our straightforward correlation-based computational strategy retrospectively uncovered the expected, known small molecule regulators for 32% of positive-control gene queries. In prospective, discovery mode, we efficiently identified new compounds related to three query genes, and validated them in subsequent gene-relevant assays, including compounds that phenocopy or pheno-oppose YAP1 overexpression and kill a Yap1-dependent sarcoma cell line. This image profile-based approach could replace many customized labor- and resource-intensive screens and accelerate the discovery of biologically and therapeutically useful compounds. One sentence summary If a genetic perturbation impacts cell morphology, a computational query can reveal compounds whose morphology “matches”.

Abstract Cells integrate mechanical cues to direct fate specification to maintain tissue function and homeostasis. While disruption of these cues is known to lead to aberrant cell behavior and chronic diseases, such as tendinopathies, the underlying mechanisms by which mechanical signals maintain cell function is not well understood. Here, we show using a novel model of tendon de-tensioning that loss of tensile cues in vivo acutely changes nuclear morphology, positioning, and expression of catabolic gene programs. Using paired ATAC/RNAseq, we further identify that a loss of cellular tension rapidly reduces chromatin accessibility in the vicinity of Yap/Taz genomic targets while also increasing expression of genes involved in matrix catabolism. Overexpression of Yap results in a reduction of chromatin accessibility at matrix catabolic gene loci, while also reducing transcriptional levels. Concordantly, depletion of Yap/Taz elevates matrix catabolic expression. Finally, we demonstrate that overexpression of Yap not only prevents the induction of a broad catabolic program following a loss of cellular tension, but also preserves the underlying chromatin state from force-induced alterations. Taken together, these results provide novel mechanistic details by which mechanical signals regulate tendon cell function to preserve matrix homeostasis through a Yap/Taz axis. Significance Statement Cells integrate mechanical signals to regulate biological outputs within tissues. These processes are required for tissue function and homeostasis. Here, we show how mechanical cues (e.g. tension) directs tendon cell function and fate at a transcriptional and epigenetic level. Furthermore, we show that disruption of these mechanical cues leads to a disease-like cell state, indicating these mechanosensitive pathways could be important for diseases driven by perturbed mechanical signaling, such as tendinopathy. Finally, we demonstrate that genetic perturbation of a single protein can preserve cell and chromatin state following a loss of tension, supporting novel avenues for the development of innovative mechano-therapeutics.

Astrocytes play a central role in the central nervous system (CNS), maintaining brain homeostasis, providing metabolic support to neurons, regulating connectivity of neural circuits, and controlling blood flow as an integral part of the blood-brain barrier. They have been increasingly implicated in the mechanisms of neurodegenerative diseases, prompting a greater need for methods that enable their study. The advent of human induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has made it possible to generate patient-specific astrocytes and CNS cells using protocols developed by our team and others as valuable disease models. Yet isolating astrocytes from primary specimens or from in vitro mixed cultures for downstream analyses has remained challenging. To address this need, we performed a screen for surface markers that allow FACS sorting of astrocytes. Here we demonstrate that CD49f is an effective marker for sorting functional human astrocytes. We sorted CD49f+ cells from a protocol we previously developed that generates a complex culture of oligodendrocytes, neurons and astrocytes from iPSCs. CD49f-purified cells express all canonical astrocyte markers and perform characteristic functions, such as neuronal support and glutamate uptake. Of particular relevance to neurodegenerative diseases, CD49f+ astrocytes can be stimulated to take on an A1 neurotoxic phenotype, in which they secrete pro-inflammatory cytokines and show an impaired ability to support neuronal maturation. This study establishes a novel marker for isolating functional astrocytes from complex CNS cell populations, strengthening the use of iPSC-astrocytes for the study of their regulation and dysregulation in neurodegenerative diseases.

In response to bone fracture, periosteal progenitor cells proliferate, expand, and differentiate to form cartilage and bone in the fracture callus. These cellular functions require the coordinated activation of multiple transcriptional programs, and the transcriptional regulators Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ) regulate osteochondroprogenitor activation during endochondral bone development. However, recent observations raise important distinctions between the signaling mechanisms used to control bone morphogenesis and repair. Here, we tested the hypothesis that YAP and TAZ regulate osteochondroprogenitor activation during endochondral bone fracture healing. Constitutive YAP and/or TAZ deletion from Osterix-expressing cells impaired both cartilage callus formation and subsequent mineralization. However, this could be explained either by direct defects in osteochondroprogenitor differentiation after fracture, or by developmental deficiencies in the progenitor cell pool prior to fractures. Consistent with the second possibility, we found that developmental YAP/TAZ deletion produced long bones with impaired periosteal thickness and cellularity. Therefore, to remove the contributions of developmental history, we next generated adult onset-inducible knockout mice (using Osx1-CretetOff) in which YAP and TAZ were deleted prior to fracture, but after normal development. Adult onset-induced YAP/TAZ deletion had no effect on cartilaginous callus formation, but impaired bone formation at 14 days post-fracture (dpf). Earlier, at 4 dpf, adult onset-induced YAP/TAZ deletion impaired the proliferation and expansion of osteoblast precursor cells located in the shoulder of the callus. Further, activated periosteal cells isolated from this region at 4 dpf exhibited impaired osteogenic differentiation in vitro upon YAP/TAZ deletion. Finally, confirming the effects on osteoblast function in vivo , adult onset-induced YAP/TAZ deletion impaired bone formation in the callus shoulder at 7 dpf, prior to the initiation of endochondral ossification. Together, these data show that YAP and TAZ promote the expansion and differentiation of periosteal osteoblast precursors to accelerate bone fracture healing.

Abstract Endochondral ossification requires coordinated mobilization of osteoblast precursors with blood vessels. During adult bone homeostasis, vessel adjacent osteoblast precursors respond to and are maintained by mechanical stimuli; however, the mechanisms by which these cells mobilize and respond to mechanical cues during embryonic development are unknown. Previously, we found that deletion of the mechanoresponsive transcriptional regulators, YAP and TAZ, from Osterix-expressing osteoblast precursors and their progeny caused perinatal lethality. Here, we show that embryonic YAP/TAZ signaling couples vessel-associated osteoblast precursor mobilization to angiogenesis in developing long bones. Osterix-conditional YAP/TAZ deletion impaired endochondral ossification in the primary ossification center but not intramembranous osteogenesis in the bone collar. Single-cell RNA sequencing revealed YAP/TAZ regulation of the angiogenic chemokine, Cxcl12, which was expressed uniquely in vessel-associated osteoblast precursors. YAP/TAZ signaling spatially coupled osteoblast precursors to blood vessels and regulated vascular morphogenesis and vessel barrier function. Further, YAP/TAZ signaling regulated vascular loop morphogenesis at the chondro-osseous junction to control hypertrophic growth plate remodeling. In human cells, mesenchymal stromal cell co-culture promoted 3D vascular network formation, which was impaired by stromal cell YAP/TAZ depletion, but rescued by recombinant CXCL12 treatment. Lastly, YAP and TAZ mediated mechanotransduction for load-induced osteogenesis in embryonic bone.

Abstract Compromised vascular supply and insufficient neovascularization impede bone repair, increasing risk of non-union. Cyr61, Cysteine-rich angiogenic inducer of 61kD (also known as CCN1), is a matricellular growth factor that is regulated by mechanical cues during fracture repair. Here, we map the distribution of endogenous Cyr61 during bone repair and evaluate the effects of recombinant Cyr61 delivery on vascularized bone regeneration. In vitro, Cyr61 treatment did not alter chondrogenesis or osteogenic gene expression, but significantly enhanced angiogenesis. In a mouse femoral fracture model, Cyr61 delivery did not alter cartilage or bone formation, but accelerated neovascularization during fracture repair. Early initiation of ambulatory mechanical loading disrupted Cyr61-induced neovascularization. Together, these data indicate that Cyr61 delivery can enhance angiogenesis during bone repair, particularly for fractures with stable fixation, and may have therapeutic potential for fractures with limited blood vessel supply.

Abstract Exposure to microgravity in low-Earth orbit (LEO) has been shown to affect human cardiovascular, musculoskeletal, and immune systems. Post-flight brain imaging indicates that reports about astronauts and mouse models suggest that microgravity may cause intracranial fluid shifts and possibly alter white and gray matter of the brain [1]. To focus on the effects of microgravity on the brain, we used induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce three-dimensional (3D) human neural organoids as models of the nervous system. We studied iPSCs derived from four individuals, including people with the neurological diseases primary progressive multiple sclerosis (PPMS) and Parkinson’s disease (PD) and non-symptomatic controls. We patterned the organoids toward cortical and dopaminergic fates representing regions of the brain affected by MS and PD, respectively. Microglia were generated from the same cell lines and integrated into a portion of the organoids. The organoids were maintained for 30 days in a novel static culture system on the International Space Station (ISS) and live samples were returned to Earth. The post-flight samples were evaluated using histology, transcriptome and secretome analysis. Microglia-specific genes and secreted proteins were detectable in the microglia-containing organoid cultures. The gene expression analyses of individual organoids cultured in LEO and on Earth suggest that cell proliferation was lower and neural cells were more mature in samples that were cultured in LEO. These experiments lay the groundwork for further studies, including long term studies to investigate the effects of microgravity on the brain. With two more missions using similar cells, we are determining whether this effect of microgravity is consistent in separate experiments. Such studies may ultimately aid in developing countermeasures for the effects of microgravity on the nervous systems of astronauts during space exploration and suggest novel therapeutic interventions for neurological diseases on Earth.