Abstract We are working toward a complete functional and genomic characterization of the cannabinoid synthase family in Cannabis (itself part of the larger Berberine Bridge Enzyme family). This clade, which is unique to Cannabis , includes four main subclades that appear to have arisen by a series of gene duplications. We have functionally characterized three cannabinoid synthases, in addition to the three already characterized, so that now all four subclades contain at least one characterized enzyme. The previously uncharacterized Clade C enzymes have relatively low activity and produce CBCA as their primary product. In addition, we report genomic characterization to better understand the structure and high level of copy number variation in this family. We report a pattern of shared regions immediately upstream of the cannabinoid synthase genes that suggests a specific sequence of breakpoints, and hence gene duplication events. We present a model of gene family expansion to account for the observed data, along with evidence that this expansion occurred under selective pressure. This work adds to our understanding of both the high level of variability in this family and the origin of THCA in type III plants lacking a functional THCAS gene.

Abstract Increased farming and cultivation of Cannabis sativa is rapidly pushing Cannabis ( Cannabis sativa L.) towards becoming a commercial agricultural commodity. Large-scale cultivation facilities maintain thousands of clonal varieties of recreational and medicinal cannabis and there is a strong market-driven motivation to maintain a commercial pipeline of clean healthy vigorously growing plants free of pathogens. However, mass production and high-capacity cultivation create an environment that is susceptible to highly transmissible pathogens and infectious entities such as Hop Latent Viroid (HLVd). From nurseries to cultivation facilities, it’s become increasingly important to maintain a routine testing regimen and ensure cultivation facilities are HLVd-free environments. One method to address the problem of infected plants is to perform thermotherapy on C. sativa explants under tissue culture conditions and isolate clean tissue to multiply productive and healthy mature plants. We carried out a novel thermotherapy method using tissue culture in 5 varieties of type III cannabis that were HLVd positive to document the degree of success of the treatment at the RNA level. We observed that following thermotherapy treatment we were able to decrease the level of HLVd positive tests in select varieties and observed some varieties were highly susceptible and unable to clear the viroid. Plants were tested using a one-step RT-qPCR method, developed and validated, in part, along with this work, and present the results as well as an exploratory transcriptome analysis of an internally developed variety, AnnaLee, which tested negative for HLVd following thermotherapy treatment, and explore possible genes of interest for viroid infection, clearance, and mitigation. Author Summary RT-qPCR and transcriptome analysis of Hops latent viroid (HLVd) in infected and non-infected Cannabis varieties. A thermotherapy procedure was conducted on HLVd infected Cannabis sativa meristem tissue maintained through tissue culture micropropagation techniques. Total RNA was isolated from the cultured plantlet stocks and evaluated by a real-time reverse transcriptase assay for HLVd. Infection status post thermotherapy was assessed, and viroid-free plants were maintained and subsequently tested. A single thermotherapy-treated cultivar, Anna Lee was selected for transcriptomics, and an analysis of the genes that were differentially regulated in infected and non-infected treated plants is discussed.

The accelerating legalization of Cannabis has opened the industry to using contemporary analytical techniques. The gene regulation and pharmacokinetics of dozens of cannabinoids remain poorly understood. Because retailers in many medical and recreational jurisdictions are required to report chemical concentrations of cannabinoids, commercial laboratories have growing chemotype datasets of diverse Cannabis cultivars. Using a data set of 17,600 cultivars tested by Steep Hill Inc., we apply machine learning techniques to interpolate missing chemotype observations and cluster cultivars together based on similarity. Our results show that cultivars cluster based on their chemotype, and that some imputation methods work better than others at grouping these cultivars based on chemotypic identity. However, due to the missing data for some of the cannabinoids their behavior could not be accurately predicted. These findings have implications for characterizing complex interactions in cannabinoid biosynthesis and improving phenotypical classification of Cannabis cultivars.

As the most widely used illicit drug, the basis of the fastest growing major industry in the US, and as a source of numerous under-studied psychoactive compounds, understanding the psychological and physiological effects of Cannabis is essential. The National Institute on Drug Abuse (NIDA) is designated as the sole legal producer of Cannabis for use in US research studies. We sought to compare the chemical profiles of Cannabis varieties that are available to consumers in states that have state-legalized use versus what is available to researchers interested in studying the plant and its effects. Our results demonstrate that the federally produced Cannabis has significantly less variety and lower concentrations of cannabinoids. Current research, which has focused on material that is far less diverse and less potent than that used by the public, limits our understanding of the plants chemical, biological, psychological, medical, and pharmacological properties. Investigation is urgently needed on the diverse forms of Cannabis used by the public in state-legal markets.

Gene copy number variation is known to be important in nearly every species where it has been examined. Alterations in gene copy number may provide a fast way of acquiring diversity, allowing rapid adaptation under strong selective pressures, and may also be a key component of standing genetic variation within species. Cannabis sativa plants produce a distinguishing set of secondary metabolites, the cannabinoids, many having medicinal utility. Two major cannabinoids --THCA and CBDA -- are products of a three-step biochemical pathway. Using genomic data for 69 Cannabis cultivars from diverse lineages within the species, we found that genes encoding the synthases in this pathway vary in copy number, and that the cannabinoid paralogs may be differentially expressed. We also found that copy number partially explains variation in cannabinoid content levels among Cannabis plants.