Abstract Vision is initiated by the rhodopsin family of light-sensitive G protein-coupled receptors (GPCRs). A photon is absorbed by the 11- cis retinal chromophore of rhodopsin which isomerises within 200 femtoseconds to the all- trans conformation, thereby initiating the cellular signal transduction processes that ultimately lead to vision. However, the intramolecular mechanism by which the photoactivated retinal induces the activation events inside rhodopsin remains elusive. In this work, we use ultrafast time-resolved crystallography at room temperature to determine how an isomerised twisted all-trans retinal stores the photon energy required to initiate protein conformational changes associated with the formation of the G protein-binding signalling state. The distorted retinal at 1 ps time-delay of photoactivation has pulled away from half of its numerous interactions with its binding pocket, and the excess of the photon energy is released through an anisotropic protein breathing motion in the direction of the extracellular space. Strikingly, the very early structural motions in the protein side chains of rhodopsin appear in regions involved in later stages of the conserved Class A GPCR activation mechanism. Our work sheds light on the earliest stages of vision in vertebrates and points to fundamental aspects of the molecular mechanisms of agonist-mediated GPCR activation.

Abstract Animal vision depends on opsins, a category of G protein-coupled receptor (GPCR) that achieves light sensitivity by covalent attachment to retinal. Typically binding as an inverse agonist in the 11-cis form, retinal photoisomerizes to the all-trans isomer and activates the receptor, initiating downstream signaling cascades. Retinal bound to bistable opsins isomerizes back to the 11-cis state after absorption of a second photon, inactivating the receptor. Bistable opsins are essential for invertebrate vision and non-visual light perception across the animal kingdom. While crystal structures are available for bistable opsins in the inactive state, it has proven difficult to form homogeneous populations of activated bistable opsins either via illumination or reconstitution with all-trans retinal. Here we show that a non-natural retinal analogue, all-trans retinal 6.11 (ATR6.11), can be reconstituted with the invertebrate bistable opsin, Jumping Spider Rhodopsin-1 (JSR1). Biochemical activity assays demonstrate that ATR6.11 functions as an agonist of JSR1. ATR6.11 binding also enables complex formation between JSR1 and downstream signaling partners. Our findings demonstrate the utility of retinal analogues for biophysical characterization of bistable opsins, which will deepen our understanding of light perception in animals.

Animal vision depends on opsins, a category of G protein-coupled receptor (GPCR) that achieves light sensitivity by covalent attachment to retinal. Typically binding as an inverse agonist, 11-cis retinal photoisomerizes to the all-trans isomer and activates the receptor, initiating downstream signaling cascades. Retinal bound to bistable opsins isomerizes back to the 11-cis state after absorption of a second photon, inactivating the receptor. Bistable opsins are essential for invertebrate vision and nonvisual light perception across the animal kingdom. While crystal structures are available for bistable opsins in the inactive state, it has proven difficult to form homogeneous populations of activated bistable opsins either via illumination or reconstitution with all-trans retinal. Here, we show that a nonnatural retinal analog, all-trans retinal 6.11 (ATR6.11), can be reconstituted with the invertebrate bistable opsin, Jumping Spider Rhodopsin-1 (JSR1). Biochemical activity assays demonstrate that ATR6.11 functions as a JSR1 agonist. ATR6.11 binding also enables complex formation between JSR1 and signaling partners. Our findings demonstrate the utility of retinal analogs for biophysical characterization of bistable opsins, which will deepen our understanding of light perception in animals.

Abstract Opsins are G protein-coupled receptors (GPCRs) that have evolved to detect light stimuli and initiate intracellular signaling cascades. Their role as signal transducers is critical to light perception across the animal kingdom. Opsins covalently bind to the chromophore 11-cis retinal, which isomerizes to the all-trans isomer upon photon absorption, causing conformational changes that result in receptor activation. Monostable opsins, responsible for vision in vertebrates, release the chromophore after activation and must bind another retinal molecule to remain functional. In contrast, bistable opsins, responsible for non-visual light perception in vertebrates and for vision in invertebrates, absorb a second photon in the active state to return the chromophore and protein to the inactive state. Structures of bistable opsins in the activated state have proven elusive, limiting our understanding of how they function as bidirectional photoswitches. Here we present active state structures of a bistable opsin, jumping spider rhodopsin isoform-1 (JSR1), in complex with its downstream signaling partners, the Gi and Gq heterotrimers. These structures elucidate key differences in the activation mechanisms between monostable and bistable opsins, offering essential insights for the rational engineering of bistable opsins into diverse optogenetic tools to control G protein signaling pathways.

Abstract The marine cyanobacterium Prochlorococcus is a main contributor to global photosynthesis, whilst being limited by iron availability. Cyanobacterial genomes typically encode two different types of FutA iron binding proteins: periplasmic FutA2 ABC transporter subunits bind Fe(III), while cytosolic FutA1 binds Fe(II). Owing to their small size and their economized genome Prochlorococcus ecotypes typically possess a single futA gene. How the encoded FutA protein might bind different Fe oxidation states was previously unknown. Here we use structural biology techniques at room temperature to probe the dynamic behavior of FutA. Neutron diffraction confirmed four negatively charged tyrosinates, that together with a neutral water molecule coordinate iron in trigonal bipyramidal geometry. Positioning of the positively charged Arg103 side chain in the second coordination shell yields an overall charge-neutral Fe(III) binding state in structures determined by neutron diffraction and serial femtosecond crystallography. Conventional rotation X-ray crystallography using a home source revealed X-ray induced photoreduction of the iron center with observation of the Fe(II) binding state; here, an additional positioning of the Arg203 side chain in the second coordination shell maintained an overall charge neutral Fe(II) binding site. Dose series using serial synchrotron crystallography and an XFEL X-ray pump-probe approach capture the transition between Fe(III) and Fe(II) states, revealing how Arg203 operates as a switch to accommodate the different iron oxidation states. This switching ability of the Prochlorococcus FutA protein may reflect ecological adaptation by genome streamlining and loss of specialized FutA proteins. Significance Statement Oceanic primary production by marine cyanobacteria is a main contributor to carbon and nitrogen fixation. Prochlorococcus is the most abundant photosynthetic organism on Earth, with an annual carbon fixation comparable to the net global primary production from agriculture. Its remarkable ecological success is based on the ability to thrive in low nutrient waters. To manage iron limitation, Prochlorococcus possesses the FutA protein for iron uptake and homeostasis. We reveal a molecular switch in the FutA protein that allows it to accommodate binding of iron in either the Fe(III) or Fe(II) state using structural biology techniques at room temperature and provide a plausible mechanism for iron binding promiscuity.

Protein–inhibitor crystal structures aid medicinal chemists in efficiently improving the potency and selectivity of small-molecule inhibitors. It is estimated that a quarter of lead molecules in drug discovery projects are halogenated. Protein–inhibitor crystal structures have shed light on the role of halogen atoms in ligand binding. They form halogen bonds with protein atoms and improve shape complementarity of inhibitors with protein binding sites. However, specific radiation damage (SRD) can cause cleavage of carbon–halogen (C– X ) bonds during X-ray diffraction data collection. This study shows significant C– X bond cleavage in protein–ligand structures of the therapeutic cancer targets B-cell lymphoma 6 (BCL6) and heat shock protein 72 (HSP72) complexed with halogenated ligands, which is dependent on the type of halogen and chemical structure of the ligand. The study found that metrics used to evaluate the fit of the ligand to the electron density deteriorated with increasing X-ray dose, and that SRD eliminated the anomalous signal from brominated ligands. A point of diminishing returns is identified, where collecting highly redundant data reduces the anomalous signal that may be used to identify binding sites of low-affinity ligands or for experimental phasing. Straightforward steps are proposed to mitigate the effects of C– X bond cleavage on structures of proteins bound to halogenated ligands and to improve the success of anomalous scattering experiments.