The regulation of gene expression is critical for organismal function and is an important source of phenotypic diversity between species. Understanding the genetic and molecular mechanisms responsible for regulatory divergence is therefore expected to provide insight into evolutionary change. Using deep sequencing, we quantified total and allele-specific mRNA expression levels genome-wide in two closely related Drosophila species ( D. melanogaster and D. sechellia ) and their F 1 hybrids. We show that 78% of expressed genes have divergent expression between species, and that cis - and trans -regulatory divergence affects 51% and 66% of expressed genes, respectively, with 35% of genes showing evidence of both. This is a relatively larger contribution of trans -regulatory divergence than was expected based on prior studies, and may result from the unique demographic history of D. sechellia . Genes with antagonistic cis - and trans -regulatory changes were more likely to be misexpressed in hybrids, consistent with the idea that such regulatory changes contribute to hybrid incompatibilities. In addition, cis -regulatory differences contributed more to divergent expression of genes that showed additive rather than nonadditive inheritance. A correlation between sequence similarity and the conservation of cis -regulatory activity was also observed that appears to be a general feature of regulatory evolution. Finally, we examined regulatory divergence that may have contributed to the evolution of a specific trait—divergent feeding behavior in D. sechellia . Overall, this study illustrates the power of mRNA sequencing for investigating regulatory evolution, provides novel insight into the evolution of gene expression in Drosophila , and reveals general trends that are likely to extend to other species.

Genetic changes affecting gene expression contribute to phenotypic divergence; thus, understanding how regulatory networks controlling gene expression change over time is critical for understanding evolution. Prior studies of expression differences within and between species have identified properties of regulatory divergence, but technical and biological differences among these studies make it difficult to assess the generality of these properties or to understand how regulatory changes accumulate with divergence time. Here, we address these issues by comparing gene expression among strains and species of Drosophila with a range of divergence times and use F 1 hybrids to examine inheritance patterns and disentangle cis - and trans -regulatory changes. We find that the fixation of compensatory changes has caused the regulation of gene expression to diverge more rapidly than gene expression itself. Specifically, we observed that the proportion of genes with evidence of cis -regulatory divergence has increased more rapidly with divergence time than the proportion of genes with evidence of expression differences. Surprisingly, the amount of expression divergence explained by cis -regulatory changes did not increase steadily with divergence time, as was previously proposed. Rather, one species ( Drosophila sechellia ) showed an excess of cis -regulatory divergence that we argue most likely resulted from positive selection in this lineage. Taken together, this work reveals not only the rate at which gene expression evolves, but also the molecular and evolutionary mechanisms responsible for this evolution.

In Lepidoptera (butterflies and moths), the genomic region around the gene cortex is a “hotspot” locus, repeatedly implicated in generating intraspecific melanic wing color polymorphisms across 100 million years of evolution. However, the identity of the effector gene regulating melanic wing color within this locus remains unknown. We show that none of the four candidate protein-coding genes within this locus, including cortex , serve as major effectors. Instead, a microRNA (miRNA), mir-193 , serves as the major effector across three deeply diverged lineages of butterflies, and its role is conserved in Drosophila . In Lepidoptera, mir-193 is derived from a gigantic primary long noncoding RNA, ivory , and it functions by directly repressing multiple pigmentation genes. We show that a miRNA can drive repeated instances of adaptive evolution in animals.

Abstract Phenotypic variation within a species is often structured geographically in clines. In Drosophila americana , a longitudinal cline for body color exists within North America that appears to be due to local adaptation. The tan and ebony genes have been hypothesized to contribute to this cline, with alleles of both genes that lighten body color found in D. americana . These alleles are similar in sequence and function to the allele fixed in D. americana’s more lightly pigmented sister species, Drosophila novamexicana . To test this hypothesis, we examined the frequency and geographic distribution of D. novamexicana -like alleles of tan and ebony in D. americana . Among alleles from over 100 strains of D. americana isolated from 21 geographic locations, we failed to identify additional alleles of tan or ebony with as much sequence similarity to D. novamexicana as the alleles previously described. However, using genetic analysis of 51 D. americana strains derived from 20 geographic locations, we identified one new allele of ebony and one new allele of tan segregating in D. americana that are functionally equivalent to the D. novamexicana allele. An additional 5 alleles of tan also showed marginal evidence of functional similarity. Given the rarity of these alleles, however, we conclude that they are unlikely to be driving the pigmentation cline. Indeed, phenotypic distributions of the 51 backcross populations analyzed indicate a more complex genetic architecture, with diversity in the number and effects of loci altering pigmentation observed both within and among populations of D. americana . This genetic heterogeneity poses a challenge to association studies and genomic scans for clinal variation, but might be common in natural populations.

Pleiotropic genes are genes that affect more than one trait. For example, many genes required for pigmentation in the fruit fly Drosophila melanogaster also affect traits such as circadian rhythms, vision, and mating behavior. Here, we present evidence that two pigmentation genes, ebony and tan, which encode enzymes catalyzing reciprocal reactions in the melanin biosynthesis pathway, also affect cuticular hydrocarbon (CHC) composition in D. melanogaster females. More specifically, we report that ebony loss-of-function mutants have a CHC profile that is biased toward long (>25C) chain CHCs, whereas tan loss-of-function mutants have a CHC profile that is biased toward short (<25C) chain CHCs. Moreover, pharmacological inhibition of dopamine synthesis, a key step in the melanin synthesis pathway, reversed the changes in CHC composition seen in ebony mutants, making the CHC profiles similar to those seen in tan mutants. These observations suggest that genetic variation affecting ebony and/or tan activity might cause correlated changes in pigmentation and CHC composition in natural populations. We tested this possibility using the Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP) and found that CHC composition covaried with pigmentation as well as levels of ebony and tan expression in newly eclosed adults in a manner consistent with the ebony and tan mutant phenotypes. These data suggest that the pleiotropic effects of ebony and tan might contribute to covariation of pigmentation and CHC profiles in Drosophila.

Phenotypic plasticity is an evolvable property of biological systems that can arise from environment-specific regulation of gene expression. To better understand the evolutionary and molecular mechanisms that give rise to plasticity in gene expression, we quantified the effects of 235 single nucleotide mutations in the Saccharomyces cerevisiae TDH3 promoter (PTDH3) on the activity of this promoter in media containing glucose, galactose, or glycerol as a carbon source. We found that the distributions of mutational effects differed among environments because many mutations altered the plastic response exhibited by the wild type allele. Comparing the effects of these mutations to the effects of 30 PTDH3 polymorphisms on expression plasticity in the same environments provided evidence of natural selection acting to prevent the plastic response in PTDH3 activity between glucose and galactose from becoming larger. The largest changes in expression plasticity were observed between fermentable (glucose or galactose) and non-fermentable (glycerol) carbon sources and were caused by mutations located in the RAP1 and GCR1 transcription factor binding sites. Mutations altered expression plasticity most frequently between the two fermentable environments, however, with mutations causing significant changes in plasticity between glucose and galactose distributed throughout the promoter, suggesting they might affect chromatin structure. Taken together, these results provide insight into the molecular mechanisms underlying gene-by-environment interactions affecting gene expression as well as the evolutionary dynamics affecting natural variation in plasticity of gene expression.

Drosophila pigmentation has been a fruitful model system for understanding the genetic and developmental mechanisms underlying phenotypic evolution. For example, prior work has shown that divergence of the tan gene contributes to pigmentation differences between two members of the virilis group: Drosophila novamexicana, which has a light yellow body color, and D. americana, which has a dark brown body color. Quantitative trait locus (QTL) mapping and expression analysis has suggested that divergence of the ebony gene might also contribute to pigmentation differences between these two species. Here, we directly test this hypothesis by using CRISPR/Cas9 genome editing to generate ebony null mutants in D. americana and D. novamexicana and then using reciprocal hemizygosity testing to compare the effects of each species' ebony allele on pigmentation. We find that divergence of ebony does indeed contribute to the pigmentation divergence between species, with effects on both the overall body color as well as a difference in pigmentation along the dorsal abdominal midline. Motivated by recent work in D. melanogaster, we also used the ebony null mutants to test for effects of ebony on cuticular hydrocarbon (CHC) profiles. We found that ebony affects CHC abundance in both species, but does not contribute to qualitative differences in the CHC profiles between these two species. Additional transgenic resources for working with D. americana and D. novamexicana, such as white mutants of both species and yellow mutants in D. novamexicana, were generated in the course of this work and are also described. Taken together, this study advances our understanding of loci contributing to phenotypic divergence and illustrates how the latest genome editing tools can be used for functional testing in non-model species.