Abstract Medulloblastoma (MB) is a heterogeneous disease in which neoplastic cells and associated immune cells contribute to disease progression. To better understand cellular heterogeneity in MB we use single-cell RNA sequencing, immunohistochemistry and deconvolution of transcriptomic data to profile neoplastic and immune populations in childhood MB samples. Neoplastic cells cluster primarily according to individual sample of origin which is in part due to the effect of chromosomal copy number gains and losses. Harmony alignment reveals novel MB subgroup/subtype-associated subpopulations that recapitulate neurodevelopmental processes and are associated with clinical outcomes, including discrete photoreceptor-like cells in MB subgroups GP3 and GP4 and nodule-associated neuronally-differentiated cells in subgroup SHH. We definitively chart the spectrum of MB immune cell infiltrates, which include subgroup/subtype-associated developmentally-related neuron-pruning and antigen presenting myeloid cells. MB cellular diversity is recapitulated in genetically engineered mouse subgroup-specific models of MB. These findings provide a clearer understanding of both the neoplastic and immune cell heterogeneity in MB.

Abstract Childhood ependymoma (EPN) is a brain tumor that has seen limited improvements in outcome over past decades. The underlying cellular components of EPN have recently been revealed by single cell RNA-sequencing (scRNAseq), providing biological insights. Here we use spatial transcriptomics to comprehensively chart gene expression across the cellular landscape of posterior fossa subgroup A (PFA) EPN, the commonest and most deadly EPN variant, providing novel resolution of cellular heterogeneity and cellular interaction. We reveal that PFA are comprised of epithelial and mesenchymal histological zones each containing a diversity of cellular states. These include co-existing and spatially distinct undifferentiated progenitor-like clusters - a quiescent mesenchymal zone population, and a second highly mitotic progenitor population that is restricted to hypercellular epithelial zones. We show that myeloid cell interaction is the leading cause of mesenchymal transition in PFA, occurring in zones spatially distinct from hypoxia-induced mesenchymal transition, and these distinct EMT-initiating processes were replicated in in-vitro models of PFA. Collectively, our transcriptomic and functional analyses mirror the processes of normal wound healing where PFA mesenchymal and epithelial zones interact with immune subpopulations in cycle of persistent tissue damage response and mitogenic re-epithelialization signals. Spatial transcriptomics advances our understanding of PFA biology, implicating a “wound that will not heal” process as a driver of tumor progression, a new concept that could provide novel targets for effective therapeutic intervention. Significance Spatial transcriptomic analysis of the ependymoma tumor microenvironment identifies novel cell populations and interactions, implicating unresolved wound healing as a clinically actionable driver of tumor progression in this refractory childhood brain tumor.

Abstract Pediatric low-grade gliomas (pLGG) comprise 35% of all brain tumors. Despite favorable survival, patients experience significant morbidity from disease and treatments. A deeper understanding of pLGG biology is essential to identify novel, more effective, and less toxic therapies. We utilized single cell RNA sequencing (scRNA-seq), spatial transcriptomics, and cytokine analyses to characterize and understand tumor and immune cell heterogeneity across pLGG. scRNA-seq revealed tumor and immune cells within the tumor microenvironment (TME). Tumor cell subsets revealed a developmental hierarchy with progenitor and mature cell populations. Immune cells included myeloid and lymphocytic cells. There was a significant difference between the prevalence of two major myeloid subclusters between pilocytic astrocytoma (PA) and ganglioglioma (GG). Bulk and single-cell cytokine analyses evaluated the immune cell signaling cascade with distinct immune phenotypes among tumor samples. KIAA1549-BRAF tumors appeared more immunogenic, secreting higher levels of immune cell activators and chemokines, compared to BRAF V600E tumors. Spatial transcriptomics revealed the differential gene expression of these chemokines and their location within the TME. A multi-pronged analysis of pLGG demonstrated the complexity of the pLGG TME and differences between genetic drivers that may influence their response to immunotherapy. Further investigation of immune cell infiltration and tumor-immune interactions is warranted. Key points There is a developmental hierarchy in neoplastic population comprising of both progenitor-like and mature cell types in both PA and GG. A more immunogenic, immune activating myeloid population is present in PA compared to GG. Functional analysis and spatial transcriptomics show higher levels of immune mobilizing chemokines in KIAA1549-BRAF fusion PA tumor samples compared to BRAF V600E GG samples. Importance of the Study While scRNA seq provides information on cellular heterogeneity within the tumor microenvironment (TME), it does not provide a complete picture of how these cells are interacting or where they are located. To expand on this, we used a three-pronged approach to better understand the biology of pediatric low-grade glioma (pLGG). By analyzing scRNA-seq, secreted cytokines and spatial orientation of cells within the TME, we strove to gain a more complete picture of the complex interplay between tumor and immune cells within pLGG. Our data revealed a complex heterogeneity in tumor and immune populations and identified an interesting difference in the immune phenotype among different subtypes.

The two types of craniopharyngioma, adamantinomatous (ACP) and papillary (PCP), are clinically relevant tumours in children and adults. Although the biology of primary craniopharyngioma is starting to be unravelled, little is known about the biology of recurrence. To fill this gap in knowledge, we have analysed through methylation array, RNA sequencing and pERK1/2 immunohistochemistry a cohort of paired primary and recurrent samples (32 samples from 14 cases of ACP and 4 cases of PCP). We show the presence of copy number alterations and clonal evolution across recurrence in 6 cases of ACP, and analysis of additional whole genome sequencing data from the Children's Brain Tumour Network confirms chromosomal arm copy number changes in at least 7/67 ACP cases. The activation of the MAPK/ERK pathway, a feature previously shown in primary ACP, is observed in all but one recurrent cases of ACP. The only ACP without MAPK activation is an aggressive case of recurrent malignant human craniopharyngioma harbouring a CTNNB1 mutation and loss of TP53. Providing support for a functional role of this TP53 mutation, we show that Trp53 loss in a murine model of ACP results in aggressive tumours and reduced mouse survival. Finally, we characterise the tumour immune infiltrate showing differences in the cellular composition and spatial distribution between ACP and PCP. Together, these analyses have revealed novel insights into recurrent craniopharyngioma and provided preclinical evidence supporting the evaluation of MAPK pathway inhibitors and immunomodulatory approaches in clinical trials in against recurrent ACP.

Treatment-induced high-grade gliomas (TIHGGs) are an incurable late complication of cranial radiation therapy or combined radiation/chemotherapy used to treat pediatric cancer. We assembled a cohort of 33 TIHGGs from multiple institutions. The primary antecedent malignancies were medulloblastoma, acute lymphoblastic leukemia, astrocytoma, and ependymoma. We performed methylation profiling, RNA-seq, and genomic sequencing (whole-genome or whole-exome) on TIHGG samples. Methylation profiling revealed that TIHGGs cluster primarily with the pediatric receptor tyrosine kinase I subtype (26/31 samples). Common TIHGG copy-number alterations include Chromosome (Ch.) 1p loss/1q gain, Ch. 4 loss, Ch. 6q loss, and Ch. 13 and Ch. 14 loss; focal alterations include PDGFRA and CDK4 gain and loss of CDKN2A and BCOR . Relative to de novo pediatric high-grade glioma (pHGG), BCOR loss (p=0.004) and CDKN2A loss (p=0.005) were significantly increased. Transcriptomic analysis identified two distinct TIHGG subgroups, one with a lesser mutation burden (0.12 mut/Mb), Ch. 1p loss/1q gain (5/6 samples), and stem cell characteristics, and one with a greater mutation burden (1.08 mut/Mb, p<0.0002), depletion of DNA repair pathways, and inflammatory characteristics. We observed increased chromothripsis in TIHGG versus pHGG (67% vs. 31%, p=0.036), which was associated with extrachromosomal circular DNA-mediated amplification of PDGFRA and CDK4 . In vitro drug screening in one primary, patient-derived TIHGG cell line from each expression subgroup identified microtubule inhibitors/stabilizers, DNA-damaging agents, MEK inhibition, and, in the inflammatory subgroup, proteasome inhibitors as potentially effective therapies. This study provides a comprehensive molecular profile of TIHGG, including mechanistic insights to TIHGG oncogenesis, and identifies potentially effective therapeutic modalities for further investigation.

Abstract Adamantinomatous Craniopharyngioma (ACP) is a rare pituitary tumor of the sellar region, with a bimodal presentation pattern in children and middle-aged adults. ACPs are primarily driven by a mutation in CTNNB1 that prevents beta-catenin from degrading properly, resulting in accumulation in the nuclei of epithelial whorl-like structures sometimes referred to as cluster cells. Clinical management is challenging due to the location of the tumor, such that complete surgical resection is often not possible so radiation therapy, which can lead to high morbidity, is also used. Greater insight into these tumors can help develop less damaging treatment strategies. In this analysis we have employed single-cell RNA sequencing technology to examine seven pediatric human ACPs (28594 cells). Using consensus non-negative matrix factorization, and traditional marker genes, we have partitioned our dataset into several cell types including cluster cells, palisading epithelial cells, microglia, T-cells, B-cells, plasma cells, and fibroblasts. Though cluster cells themselves do not actively proliferate, we believe the complex inter-cellular signaling is responsible for tumor formation. We propose a model in which malignant fibroblasts form from the existing epithelium and remodel the extracellular matrix (ECM) creating a stiffened tumor microenvironment. To support this claim we show activation markers suggesting myofibroblast differentiation, the expression of EMT signatures indicating a transformation from epithelial to fibroblast, and RNA velocity analysis that demonstrates lineage tracing. We believe that the remodeling of the ECM is a wound healing response influenced by TGF-beta, SPP1, and other signaling pathways. Our analysis of ACPs reveals the role of the tumor microenvironment in the formation of these tumors.

High throughput data is commonplace in biomedical research as seen with technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and other Next Generation Sequencing technologies. As these techniques continue to be increasingly utilized it is critical to have analysis tools that can identify meaningful complex relationships between variables (i.e., in the case of scRNA-seq: genes) in a way such that human bias is absent. Moreover, it is equally paramount that both linear and non-linear (i.e., one-to-many) variable relationships be considered when contrasting datasets. HD Spot is a deep learning-based framework that generates an optimal interpretable classifier a given high-throughput dataset using a simple genetic algorithm as well as an autoencoder to classifier transfer learning approach. Using four unique publicly available scRNA-seq datasets with published ground truth, we demonstrate the robustness of HD Spot and the ability to identify ontologically accurate gene lists for a given data subset. HD Spot serves as a bioinformatic tool to allow novice and advanced analysts to gain complex insight into their respective datasets enabling novel hypotheses development.