ABSTRACT Altered glycosylation is an undisputed corollary of cancer development. Understanding these alterations is paramount but hampered by limitations underlying cellular model systems. For instance, the intricate interactions between tumour and host cannot be adequately recapitulated in monoculture of tumour-derived cell lines. More complex co-culture models usually rely on sorting procedures for proteome analyses and rarely capture the details of protein glycosylation. Here, we report a strategy termed Bio-Orthogonal Cell line-specific Tagging of Glycoproteins (BOCTAG). Cells are equipped by transfection with an artificial biosynthetic pathway that transforms bioorthogonally tagged sugars into the corresponding nucleotide-sugars. Only transfected cells incorporate bioorthogonal tags into glycoproteins in the presence of non-transfected cells. We employ BOCTAG as an imaging technique and to annotate cell-specific glycosylation sites in mass spectrometry-glycoproteomics. We demonstrate application in co-culture and mouse models, allowing for profiling of the glycoproteome as an important modulator of cellular function.

Abstract Proximity labelling provides a powerful in vivo tool to characterize the proteome of sub-cellular structures and the interactome of specific proteins. Using the highly active biotin ligase TurboID, we optimize a proximity labelling protocol for C. elegans . We use this protocol to characterise the proteomes of the worm’s gut, muscle, skin, and nervous system. We express TurboID exclusively in the pair of AFD neurons and show we can identify known and previously unknown proteins expressed selectively in AFD. We knock TurboID into the endogenous elks-1 gene, which encodes a presynaptic active zone protein. We identify many known ELKS-1 interacting proteins as well as previously uncharacterised synaptic proteins. Versatile vectors, and the inherent advantage of C. elegans for biochemistry, make proximity labelling a valuable addition to the nematode’s armory. Teaser We optimize a TurboID proximity labeling protocol for C. elegans and use it to characterize tissue and synaptic proteomes

Summary Autophagy is essential for neuronal development and its deregulation contributes to neurodegenerative diseases. NDR1 and NDR2 are highly conserved kinases implicated in neuronal development, mitochondrial health and autophagy, but how they affect mammalian brain development in vivo is not known. Using single and double Ndr1/2 knockout mouse models we show that, dual, but not individual loss of Ndr1/2 in neurons causes neurodegeneration during brain development, but also in adult mice. Proteomic and phosphoproteomic comparisons between Ndr1/2 knockout and control brains revealed novel kinase substrates and indicated that endocytosis is significantly affected in the absence of NDR1/2. We validated the endocytic protein, Raph1/Lpd1 as a novel NDR1/2 substrate and showed that both NDR1/2 and Raph1 are critical for endocytosis and membrane recycling. In NDR1/2 knockout brains, we observed prominent accumulation of transferrin receptor, p62 and ubiquitinated proteins, indicative of a major impairment of protein homeostasis. Furthermore, the levels of LC3-positive autophagosomes were reduced in knockout neurons, implying that reduced autophagy efficiency mediates p62 accumulation and neurotoxicity. Mechanistically, pronounced mislocalisation of the transmembrane autophagy protein ATG9A at the neuronal periphery, impaired axonal ATG9A trafficking and increased ATG9A surface levels further confirm defects in membrane trafficking and could underlie the impairment in autophagy. We provide novel insight into the roles of NDR1/2 kinases in maintaining neuronal health. Highlights Dual neuronal Ndr1 and Ndr2 knockout during development or in adult mice causes neurodegeneration. Phosphoproteomics comparison of Ndr1/2 knockouts with control littermates shows endocytosis and membrane trafficking to be affected and reveals novel substrates. Raph1/Lamellipodin is a novel NDR1/2 substrate that is required for TfR endocytosis. Ndr1/2 knockout brains exhibit a severe defect in ubiquitinated protein clearance and reduced autophagy. NDR1/2 and Raph1 are required for the trafficking of the only transmembrane autophagy protein, ATG9A.

The eukaryotic replisome, organized around the Cdc45-MCM-GINS (CMG) helicase, orchestrates chromosome replication. Multiple factors associate directly with CMG including Ctf4 and the heterotrimeric fork protection complex (Csm3/Tof1 and Mrc1), that have important roles including aiding normal replication rates and stabilizing stalled forks. How these proteins interface with CMG to execute these functions is poorly understood. Here we present 3-3.5 Å resolution cryo-EM structures comprising CMG, Ctf4, Csm3/Tof1 and Mrc1 at a replication fork. The structures provide high-resolution views of CMG:DNA interactions, revealing the mechanism of strand separation. Furthermore, they illustrate the topology of Mrc1 in the replisome and show Csm3/Tof1 'grips' duplex DNA ahead of CMG via a network of interactions that are important for efficient replication fork pausing. Our work reveals how four highly conserved replisome components collaborate with CMG to facilitate replisome progression and maintain genome stability.

Aurora A is a cell cycle protein kinase implicated in multiple human cancers, and several Aurora A-specific kinase inhibitors have progressed into clinical trials. In this study, we report structural and cellular analysis of a novel biochemical mode of Aurora A inhibition, which occurs through reversible covalent interaction with the universal metabolic integrator coenzyme A (CoA). Mechanistically, the CoA 3'-phospho ADP moiety interacts with Thr 217, an Aurora A selectivity filter, which permits the formation of an unprecedented covalent bond with Cys 290 in the kinase activation segment, lying some 15 A away. CoA modification (CoAlation) of endogenous Aurora A is rapidly induced by oxidative stresses at Cys 290 in human cells, and microinjection of CoA into mouse embryos perturbs meitoic spindle formation and chromosome alignment. Aurora A regulation by CoA reveals how targeting of Aurora A might be accomplished in the future by development of a 'double-anchored' covalent inhibitor.

Besides well-known immune roles, the evolutionarily ancient cytokine interleukin-17 (IL-17) modulates neural circuit function. We investigate how IL-17 signals in neurons, and the extent to which this signaling can alter organismal phenotypes. We combine immunoprecipitation and mass spectrometry to biochemically characterize endogenous signaling complexes that function downstream of IL-17 receptors in C. elegans (Ce) neurons. We identify the Ce ortholog of MALT1 as a critical output of the pathway. MALT1 was not previously implicated in IL-17 signaling or in nervous system function. MALT1 forms a complex with homologs of Act1 and IRAK and functions both as a scaffold for IκB recruitment, and as a protease. MALT1 is expressed broadly in the Ce nervous system, and neuronal IL-17-MALT1 signaling regulates many phenotypes, including escape behavior, associative learning, immunity and longevity. Our data suggest MALT1 has an ancient role modulating neural function downstream of IL-17 to remodel physiological and behavioral state.

Abstract We previously reported that the Plasmodium falciparum putative serine/threonine protein phosphatase 7 (PP7) is a high confidence substrate of the cAMP-dependent protein kinase (PKA). Here we explore the function of PP7 in asexual P. falciparum blood stage parasites. We show that conditional disruption of PP7 leads to a severe growth arrest. We show that PP7 is a calcium-dependent phosphatase which interacts with calmodulin and calcium-dependent protein kinase 1 (CDPK1), consistent with a role in calcium signalling. Notably, PP7 was found to be dispensable for erythrocyte invasion, but was crucial for ring-stage development, with PP7-null parasites arresting shortly following invasion and showing no transition to ameboid forms. Phosphoproteomic analysis revealed that PP7 may regulate dephosphorylation of PKAc substrates, particularly in the presence of Ca 2+ . Its interaction with calmodulin and CDPK1 further emphasise a role in calcium signalling, while its impact on early ring development and PKAc substrate phosphorylation underscores its importance in parasite development.

Abstract mTORC1 is a kinase complex regulating cell growth, proliferation and survival. Because mis-regulation of DEPTOR, an endogenous mTORC1 inhibitor, is associated with some cancers, we reconstituted mTORC1 with DEPTOR to understand its function. We find that DEPTOR is a unique partial mTORC1 inhibitor that may have evolved to preserve feedback inhibition of PI3K. Counterintuitively, mTORC1 activated by RHEB or oncogenic mutation is much more potently inhibited by DEPTOR. Although DEPTOR partially inhibits mTORC1, mTORC1 prevents this inhibition by phosphorylating DEPTOR, a mutual antagonism that requires no exogenous factors. Structural analyses of the mTORC1/DEPTOR complex showed DEPTOR’s PDZ domain interacting with the mTOR FAT region, and the unstructured linker preceding the PDZ binding to the mTOR FRB domain. Here we show, in contrast to previous cellular studies, that both the PDZ and linker regions are essential for inhibition, and it is likely that interaction with the FRB is crucial to the unique partial inhibition.

Summary Chemoproteomics is a powerful method capable of detecting interactions between small molecules and the proteome, however its use as a high-throughput screening method for chemical libraries has so far been limited. To address this need, we have further developed a chemoproteomics workflow to screen cysteine reactive covalent fragments in cell lysates against the deubiquitinating (DUB) enzymes using activity-based protein profiling. By using targeted ubiquitin probes, we have addressed sensitivity and affinity limitations, enabling target identification and covalent fragment library profiling in a 96-well plate format. The use of data independent acquisition (DIA) methods for MS analysis combined with automated Evosep liquid chromatography (LC) reduced instrument runtimes to 21 minutes per sample and simplified the workflow. In this proof-of-concept study, we have profiled 138 covalent fragments against 57 DUB proteins and validated four hit fragments against OTUD7B and UCHL3 through site identification experiments and orthogonal biochemical activity assays. Graphical abstract

Abstract N6 -methyladenosine (m6A), the most abundant mRNA modification, is deposited in mammals/insects/plants by m6A methyltransferase complexes (MTC) comprising a catalytic subunit and at least five additional proteins. The yeast MTC is critical for meiosis and was known to comprise three proteins, of which two were conserved. We uncover three novel MTC components (Kar4/Ygl036w-Vir1/Dyn2). All MTC subunits, except for Dyn2, are essential for m6A deposition and have corresponding mammalian MTC orthologs. Unlike the mammalian bipartite MTC, the yeast MTC is unipartite, yet multifunctional. The mRNA interacting module, comprising Ime4, Mum2, Vir1, and Kar4, exerts the MTC’s m6A-independent function, while Slz1 enables the MTC catalytic function in m6A deposition. Both functions are critical for meiotic progression. Kar4 also has a mechanistically separate role from the MTC during mating. The yeast MTC constituents play distinguishable m6A-dependent, MTC-dependent and MTC-independent functions, highlighting their complexity and paving the path towards dissecting multi-layered MTC functions in mammals.