Although subcellular mRNA trafficking has been demonstrated as a mechanism to control protein distribution, it is generally believed that most protein localization occurs subsequent to translation. To address this point, we developed and employed a high-resolution fluorescent in situ hybridization procedure to comprehensively evaluate mRNA localization dynamics during early Drosophila embryogenesis. Surprisingly, of the 3370 genes analyzed, 71% of those expressed encode subcellularly localized mRNAs. Dozens of new and striking localization patterns were observed, implying an equivalent variety of localization mechanisms. Tight correlations between mRNA distribution and subsequent protein localization and function, indicate major roles for mRNA localization in nucleating localized cellular machineries. A searchable web resource documenting mRNA expression and localization dynamics has been established and will serve as an invaluable tool for dissecting localization mechanisms and for predicting gene functions and interactions.

For more than 100 years, the fruit fly

Abstract Proper differentiation of sperm from germline stem cells, essential for production of the next generation, requires dramatic changes in gene expression that drive remodeling of almost all cellular components, from chromatin to organelles to cell shape itself. Here we provide a single nucleus and single cell RNA-seq resource covering all of spermatogenesis in Drosophila starting from in-depth analysis of adult testis single nucleus RNA-seq (snRNA-seq) data from the Fly Cell Atlas (FCA) study (Li et al ., 2022). With over 44,000 nuclei and 6,000 cells analyzed, the data provide identification of rare cell types, mapping of intermediate steps in differentiation, and the potential to identify new factors impacting fertility or controlling differentiation of germline and supporting somatic cells. We justify assignment of key germline and somatic cell types using combinations of known markers, in situ hybridization, and analysis of extant protein traps. Comparison of single cell and single nucleus datasets proved particularly revealing of dynamic developmental transitions in germline differentiation. To complement the web-based portals for data analysis hosted by the FCA, we provide datasets compatible with commonly used software such as Seurat and Monocle. The foundation provided here will enable communities studying spermatogenesis to interrogate the datasets to identify candidate genes to test for function in vivo .

Abstract Dosage compensation (DC) is a mechanism by which X chromosome transcription is equalized in the somatic cells of both males and females. In male fruit flies, expression levels of the X-chromosome are increased two-fold to compensate for their single X chromosome. In testis, dosage compensation is thought to cease during meiosis, however, the timing and degree of the resulting transcriptional suppression is difficult to separate from global meiotic downregulation of each chromosome. To address this, we analyzed testis single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data from two Drosophila melanogaster strains. We found evidence that the X chromosome is equally transcriptionally active as autosomes in somatic and pre-meiotic cells, and less transcriptionally active than autosomes in meiotic and post-meiotic cells. In cells experiencing dosage compensation, close proximity to MSL (male-specific lethal) chromatin entry sites (CES) correlates with increased X chromosome transcription. We found low or undetectable level of germline expression of most msl genes, mle, roX1 and roX2 via sequencing or RNA-FISH, and no evidence of germline nuclear roX1/2 localization. Our results suggest that, although DC occurs in somatic and premeiotic germ cells in Drosophila testis, there might be non-canonical factors involved in the dosage compensation. The single-cell expression patterns and enrichment statistics of detected genes can be explored interactively in our database: https://zhao.labapps.rockefeller.edu/gene-expr/ .

Bile acids (BAs) are core gastrointestinal metabolites with dual functions in lipid absorption and cell signaling. BAs circulate between the liver and distal small intestine (i.e., ileum), yet the dynamics through which complex BA pools are absorbed in the ileum and interact with host intestinal cells in vivo remain poorly understood. As ileal absorption is rate-limiting in determining which BAs in the intestinal lumen gain access to host intestinal cells and receptors, and at what concentrations, we hypothesized that defining the rates and routes of ileal BA absorption in vivo would yield novel insights into the physiological forms and functions of mouse enterohepatic BA pools.

Summary Cells and organisms adjust their growth based on the availability of cholesterol, which is essential for cellular functions. However, the mechanisms by which cells sense cholesterol levels and translate these into growth signals are not fully understood. We report that cholesterol rapidly activates the master growth-regulatory TOR pathway in Drosophila tissues. We identify the nuclear receptor HR3, an ortholog of mammalian RORα, as an essential factor in cholesterol-induced TOR activation. We demonstrate that HR3 binds cholesterol and promotes TOR pathway activation through a non-genomic mechanism acting upstream of the Rag GTPases. Similarly, we find that RORα is necessary for cholesterol-mediated TOR activation in human cells, suggesting that HR3/RORα represents a conserved mechanism for cholesterol sensing that couples cholesterol availability to TOR-pathway activity. These findings advance our understanding of how cholesterol influences cell growth, with implications for cholesterol-related diseases and cancer. Highlights Cholesterol leads to dynamic TOR pathway activation, driving systemic growth HR3 in Drosophila binds cholesterol and couples its availability to TOR activation HR3 acts upstream of Rag GTPases to activate TOR in response to lysosomal cholesterol Mammalian HR3 ortholog RORα is required for cholesterol-induced TOR activation

Abstract Cryptococcus neoformans is one of the leading causes of invasive fungal infection in humans worldwide. C. neoformans uses macrophages as a proliferative niche to increase infective burden and avoid immune surveillance. However, the specific mechanisms by which C. neoformans manipulates host immunity to promote its growth during infection remain ill-defined. Here we demonstrate that eicosanoid lipid mediators manipulated and/or produced by C. neoformans play a key role in regulating pathogenesis. C. neoformans is known to secrete several eicosanoids that are highly similar to those found in vertebrate hosts. Using eicosanoid deficient cryptococcal mutants Δplb1 and Δlac1 , we demonstrate that prostaglandin E 2 is required by C. neoformans for proliferation within macrophages and in vivo during infection. Genetic and pharmacological disruption of host PGE 2 synthesis is not required for promotion of cryptococcal growth by eicosanoid production. We find that PGE 2 must be dehydrogenated into 15-keto-PGE 2 to promote fungal growth, a finding that implicated the host nuclear receptor PPAR- γ . C. neoformans infection of macrophages activates host PPAR- γ and its inhibition is sufficient to abrogate the effect of 15-keto-PGE 2 in promoting fungal growth during infection. Thus, we describe the first mechanism of reliance on pathogen-derived eicosanoids in fungal pathogenesis and the specific role of 15-keto-PGE 2 and host PPAR- γ in cryptococcosis. Author Summary Cryptococcus neoformans is an opportunistic fungal pathogen that is responsible for significant numbers of deaths in the immunocompromised population worldwide. Here we address whether eicosanoids produced by C. neoformans manipulate host innate immune cells during infection. Cryptococcus neoformans produces several eicosanoids that are notable for their similarity to vertebrate eicosanoids, it is therefore possible that fungal-derived eicosanoids may provoke physiological effects in the host. Using a combination of in vitro and in vivo infection models we identify a specific eicosanoid species - prostaglandin E 2 – that is required by C. neoformans for growth during infection. We subsequently show that prostaglandin E 2 must be converted to 15-keto-prostaglandin E 2 within the host before it has these effects. Furthermore, we find that prostaglandin E 2 /15-keto-prostaglandin E 2 mediated virulence is via activation of host PPAR- γ – an intracellular eicosanoid receptor known to interact with 15-keto-PGE 2 .

Background and purpose: Based on the mimicry of microbial metabolites, functionalized indoles were demonstrated as the ligands and agonists of the pregnane xenobiotic receptor. The lead indole, FKK6, displayed pregnane xenobiotic receptor-dependent protective effects in DSS induced colitis in mice and in vitro cytokine-treated intestinal organoid cultures. Here, we performed the initial in vitro pharmacological profiling of FKK6. Experimental approach: A complex series of cell-free and cell-based assays were employed. The organic synthesis, and advanced analytical chemistry methods were used. Key results: FKK6-pregnane xenobiotic receptor interactions were characterized by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Screening FKK6 against potential cellular off-targets revealed high pregnane xenobiotic receptor selectivity. FKK6 has poor aqueous solubility but was highly soluble in simulated gastric and intestinal fluids. FKK6 was bound to plasma proteins and chemically stable in plasma. The partition coefficient of FKK6 was 2.70, and FKK6 moderately partitioned into red blood cells. In Caco2 cells, FKK6 displayed high permeability (A-B: 22.8 times 10-6 cm.s-1) and no active efflux. These data are indicative of essentially complete in vivo absorption of FKK6. FKK6 was rapidly metabolized by cytochromes P450, notably by CYP3A4 in human liver microsomes. Two oxidized FKK6 derivatives, including N6 oxide and C19-phenol, were detected, and these metabolites had 5-7 times lower potency as pregnane xenobiotic receptor agonists than FKK6. This implies that despite high intestinal absorption, FKK6 is rapidly eliminated by the liver, and its pregnane xenobiotic receptor effects are predicted to be predominantly in the intestines. Conclusion and implications: The pregnane xenobiotic receptor ligand and agonist FKK6 has a suitable pharmacological profile supporting its potential preclinical development.

We have investigated the relationship between the function of the gene hindsight ( hnt ), which is the Drosophila homolog of Ras Responsive Element Binding protein-1 ( RREB-1 ), and the EGFR signaling pathway. We report that hnt mutant embryos are defective in EGFR signaling dependent processes, namely chordotonal organ recruitment and oenocyte specification. We also show the temperature sensitive hypomorphic allele hntpebbled is enhanced by the hypomorphic MAPK allele rolled ( rl1 ). We find that hnt overexpression results in ectopic DPax2 expression within the embryonic peripheral nervous system, and we show that this effect is EGFR-dependent. Finally, we show that the canonical U-shaped embryonic lethal phenotype of hnt , which is associated with premature degeneration of the extraembyonic amnioserosa and a failure in germ band retraction, is rescued by expression of several components of the EGFR signaling pathway ( sSpi , Ras85DV12 , pntP1 ) as well as the caspase inhibitor p35 . Based on this collection of corroborating evidence, we suggest that an overarching function of hnt involves the positive regulation of EGFR signaling.

Prolonged exposure to glucocorticoid stress hormones precipitates mood and cognitive disorders. We identified arginine and glutamate rich 1 (ARGLU1) in a screen for new modulators of glucocorticoid signaling in the CNS. Biochemical studies found that the glutamate rich C-terminus coactivates the glucocorticoid receptor (GR) and the arginine rich N-terminus interacts with splicing factors and RNA. RNA-seq of neuronal cells +/- siARGLU1 found significant changes in the expression and alternative splicing of distinct genes involved in neurogenesis. Loss of ARGLU1 was embryonic lethal in mice, and knockdown in zebrafish caused neurodevelopmental and heart defects. Treatment with dexamethasone, a GR activator, also induced changes in the pattern of alternatively spliced genes, highlighting an underappreciated global mechanism of glucocorticoid action in neuronal cells. Thus, in addition to its basal role, ARGLU1 links glucocorticoid-mediated transcription and alternative splicing in neural cells, providing new avenues from which to investigate the molecular underpinnings of cognitive stress disorders.