SUMMARY Homologous recombination (HR) is a conservative DNA repair pathway in which intact homologous sequences are used as a template for repair. How the homology search happens in the crowded space of the cell nucleus is, however, still poorly understood. Here, we measured global chromosome and double-strand break (DSB) site mobility in Arabidopsis thaliana , using lacO /LacI lines and two GFP-tagged HR reporters. We observed an increase in global chromatin mobility upon the induction of DNA damage, specifically at the S/G2 phases of the cell cycle. DSB sites showed remarkably high mobility levels at the early HR stage, with a subsequent drastic decrease in mobility associated with the relocation of DSBs to the nucleus periphery. Importantly, the increase in mobility was lost in sog1-1 mutant, a central transcription factor of the DNA damage response in plants. Our results indicate that repair mechanisms actively regulate chromatin mobility upon DNA damage, implying an important role for this process during the early steps of the DNA damage response.

Abstract The study of the independent evolution of similar characters can highlight important ecological and genetic factors that drive phenotypic evolution. The transition from reproduction by outcrossing to self-fertilization has occurred frequently throughout plant evolution. A common trend in this transition is the reduction of flower features in the selfing lineages, including display size, flower signals and pollinators’ rewards. These changes are believed to evolve because resources invested in building attractive flowers are reallocated to other fitness functions as the pressures to attract pollinators decrease. We investigated the similarities in the evolution of flower fragrance after independent transitions to self-fertilization in Capsella . We identified a large number of compounds that are similarly changed in different selfer lineages, such that the composition of the flower scent can predict the mating system in this genus. We further demonstrate that the emission of some of these compounds convergently evolved based on mutations in different genes. In one of the Capsella selfing lineages, the loss of β -ocimene emission was caused by a mutation altering subcellular localization of the ortholog of TERPENE SYNTHASE 2 without apparent effects on its biosynthetic activity. This mutation appears to have been selected at the early stage of this selfing lineage establishment through the capture of a variant segregating in the ancestral outcrossing population. The large extent of convergence in the independent evolution of flower scent, together with the evolutionary history and molecular consequences of a causal mutation, suggest that the emission of specific volatiles has important fitness consequences in self-fertilizing plants without obvious energetic benefits.

Abstract Quantitative gene regulation at the cell population-level can be achieved by two fundamentally different modes of regulation at individual gene copies. A “digital” mode involves binary ON/OFF expression states, with population-level variation arising from the proportion of gene copies in each state, while an “analog” mode involves graded expression levels at each gene copy. At the Arabidopsis floral repressor FLOWERING LOCUS C (FLC), “digital” Polycomb silencing is known to facilitate quantitative epigenetic memory in response to cold. However, whether FLC regulation before cold involves analog or digital modes is unknown. Using quantitative fluorescent imaging of FLC mRNA and protein, together with mathematical modelling, we find that FLC expression before cold is regulated by both analog and digital modes. We observe a temporal separation between the two modes, with analog preceding digital. The analog mode can maintain intermediate expression levels at individual FLC gene copies, before subsequent digital silencing, consistent with the copies switching OFF stochastically and heritably without cold. This switch leads to a slow reduction in FLC expression at the cell population-level. These data present a new paradigm for gradual repression, elucidating how analog transcriptional and digital epigenetic memory pathways can be integrated.

ABSTRACT Multicellular organisms result from complex developmental processes largely orchestrated through the quantitative spatiotemporal regulation of gene expression. Yet, obtaining absolute counts of mRNAs at a 3-dimensional resolution remains challenging, especially in plants, due to high levels of tissue autofluorescence that prevent the detection of diffraction-limited fluorescent spots. In situ hybridization methods based on amplification cycles have recently emerged, but they are laborious and often lead to quantification biases. In this article, we present a simple method based on single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) to visualize and count the number of mRNA molecules in several intact plant tissues. In addition, with the use of fluorescent protein reporters, our method also enables simultaneous detection of mRNA and protein quantity, as well as subcellular distribution, in single cells. With this method, research in plants can now fully explore the benefits of the quantitative analysis of transcription and protein levels at cellular and subcellular resolution in plant tissues.

Summary Throughout their lifecycle, plants are subjected to DNA damage from various sources, both environmental and endogenous. Investigating the mechanisms of the DNA damage response (DDR) is essential to unravel how plants adapt to the changing environment, which can induce varying amounts of DNA damage. Using a combination of whole‐mount single‐molecule RNA fluorescence in situ hybridization (WM‐smFISH) and plant cell cycle reporter lines, we investigated the transcriptional activation of a key homologous recombination (HR) gene, RAD51 , in response to increasing amounts of DNA damage in Arabidopsis thaliana roots. The results uncover consistent variations in RAD51 transcriptional response and cell cycle arrest among distinct cell types and developmental zones. Furthermore, we demonstrate that DNA damage induced by genotoxic stress results in RAD51 transcription throughout the whole cell cycle, dissociating its traditional link with S/G2 phases. This work advances the current comprehension of DNA damage response in plants by demonstrating quantitative differences in DDR activation. In addition, it reveals new associations with the cell cycle and cell types, providing crucial insights for further studies of the broader response mechanisms in plants.

Abstract Nitrate is a nutrient and signal that regulates gene expression. The nitrate response has been extensively characterized at the organism, organ, and cell‐type‐specific levels, but intracellular mRNA dynamics remain unexplored. To characterize nuclear and cytoplasmic transcriptome dynamics in response to nitrate, we performed a time‐course expression analysis after nitrate treatment in isolated nuclei, cytoplasm, and whole roots. We identified 402 differentially localized transcripts (DLTs) in response to nitrate treatment. Induced DLT genes showed rapid and transient recruitment of the RNA polymerase II, together with an increase in the mRNA turnover rates. DLTs code for genes involved in metabolic processes, localization, and response to stimulus indicating DLTs include genes with relevant functions for the nitrate response that have not been previously identified. Using single‐molecule RNA FISH, we observed early nuclear accumulation of the NITRATE REDUCTASE 1 ( NIA1 ) transcripts in their transcription sites. We found that transcription of NIA1 , a gene showing delayed cytoplasmic accumulation, is rapidly and transiently activated; however, its transcripts become unstable when they reach the cytoplasm. Our study reveals the dynamic localization of mRNAs between the nucleus and cytoplasm as an emerging feature in the temporal control of gene expression in response to nitrate treatment in Arabidopsis roots.

ABSTRACT Nitrate (NO 3 - ) is a signaling molecule that regulates gene expression in plants. The nitrate response has been extensively characterized at the transcriptome level. However, we know little about RNA nucleocytoplasmic dynamics during nitrate response. To understand the role of mRNA localization during the nitrate response, we isolated mRNA from the nucleus, cytoplasm, and whole-cells from nitrate-treated Arabidopsis roots and performed RNA-seq. We identified 402 differentially localized transcripts (DLTs) in response to nitrate. DLTs were enriched in GO-terms related to metabolism, response to stimulus, and transport. DLTs showed five localization patterns: nuclear reduction, cytoplasmic reduction, nuclear accumulation, cytoplasmic accumulation, or delayed-cytoplasmic accumulation in response to nitrate. DLTs exhibited large changes in RNA polymerase II occupancy of cognate genes and high mRNA turnover rates, indicating these are rapidly replaced mRNAs. The NITRATE REDUCTASE 1 ( NIA1 ) transcript exhibited the largest changes in synthesis and decay. Using single-molecule RNA FISH, we showed that NIA1 nuclear accumulation occurs mainly at transcription sites. The decay profiles for NIA1 showed a higher half-life when the transcript accumulated in the nucleus than in the cytoplasm. We propose that regulating nucleocytoplasmic mRNA distribution allows tuning transcript availability of fastly replaced mRNAs, controlling plants’ adaptive response to nitrogen nutrient signals.

RESUME Gene expression is governed by several layers of regulation which in addition to genome organization, local chromatin structure, gene accessibility and the presence of transcription factors also includes gene positioning. Although basic mechanisms are expected to be conserved in Eukaryotes, surprisingly little information on the role of gene positioning is available in plant cells, mainly due to the lack of a highly resolutive approach. In this manuscript, we adapted the use of the ANCHOR system to perform real-time single-locus detection in planta. ANCHOR is a DNA-labelling tool derived from the partitioning system. We demonstrate its suitability to monitor a single-locus in planta and used this approach to track chromatin mobility during cell differentiation in Arabidopsis root epidermal cells. Finally, we discuss the potential of this approach to investigate the role of gene positioning during transcription and DNA repair in plants.

ABSTRACT Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) has emerged as a powerful tool to study gene expression dynamics with unparalleled precision and spatial resolution in a variety of biological systems. Recent advancements have expanded its application to encompass plant studies, yet a demand persists for a simple and robust smFISH method adapted to plant tissue sections. Here, we present an optimized smFISH protocol (cryo-smFISH) for visualizing and quantifying single mRNA molecules in plant tissue cryosections. This method exhibits remarkable sensitivity, capable of detecting low-expression transcripts, including long non-coding RNAs. Integrating a deep learning-based algorithm in our image analysis pipeline, our method enables us to assign RNA abundance precisely in nuclear and cytoplasmic compartments. Compatibility with Immunofluorescence also allows RNA and endogenous proteins to be visualized and quantified simultaneously. Finally, this study presents for the first time the use of smFISH for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) validation in plants. By extending the smFISH method to plant cryosections, an even broader community of plant scientists will be able to exploit the multiple potentials of quantitative transcript analysis at cellular and subcellular resolutions.