Targeting gene function with spatial or temporal specificity is a key goal in molecular genetics. CRISPR-Cas9 has greatly facilitated this strategy, but some standard approaches are problematic. For instance, simple tissue-specific or global overexpression of Cas9 can cause significant lethality or developmental delays even in the absence of gRNAs. In particular, we found that Gal4-mediated expression of UAS-Cas9 in the Drosophila prothoracic gland (PG) was not a suitable strategy to disrupt gene expression, since Cas9 alone caused widespread lethality. The PG gland is widely used for studying endocrine gland function during animal development, but tools validating PG-specific RNAi phenotypes are lacking. Here, we present a collection of modular gateway-compatible CRISPR-Cas9 tools that allow precise modulation of target gene activity with temporal and spatial specificity. We also demonstrate that Cas9 fused to the progesterone ligand-binding domain can be used to activate gene expression via RU486. Using these approaches, we were able to avoid the lethality associated with simple GAL4-mediated overexpression of Cas9 in the PG. Given that the PG is a polytene tissue, we conclude that these tools work effectively in endoreplicating cells where Cas9 has to target multiple copies of the same locus. Our toolkit can be easily adapted for other tissues and can be used both for gain- and loss-of-function studies.

ABSTRACT Recent studies have revealed a role for RNA in the repair of DNA double-strand breaks. Here, we show that the asymmetric DNA overhangs generated by the small TevSaCas9 dual nuclease informs a simple and robust editing strategy in human cells whereby Polθ and Rad52 are recruited to repair the double-strand break. The 2-nt, 3’ DNA overhang generated by the I-TevI nuclease domain of TevSaCas9 hybridizes with the 3’ end of a co-localized repair template guide RNA to specifically license repair. Substitutions that destabilize the repair duplex reduce editing efficiency. Targeted RNA-templated repair (rep-editing) harnesses cellular RNA-based DNA repair pathways to introduce precise nucleotide edits, deletions and insertions in human cells with high efficiency and fidelity independent of co-delivered repair functions. The small size of TevSaCas9 and RNA repair template offers delivery advantages over size-constrained or multi-component editing systems.

Summary Advances in CRISPR technology have immensely improved our ability to manipulate nucleic acids, and the recent discovery of the RNA-targeting endonuclease Cas13 adds even further functionality. Here, we show that Cas13 works efficiently in Drosophila , both ex vivo and in vivo . We tested 44 different Cas13 variants to identify enzymes with the best overall performance and showed that Cas13 could target endogenous Drosophila transcripts in vivo with high efficiency and specificity. We also developed Cas13 applications to edit mRNAs and target mitochondrial transcripts. Our vector collection represents a versatile tool collection to manipulate gene expression at the post-transcriptional level.

Abstract Intravenous injection provides a direct, rapid, and efficient route for delivering drugs or other substances, particularly for compounds with poor intestinal absorption or molecules (e.g. proteins) that are prone to structural changes and degradation within the digestive system. While Drosophila larvae represent a well-established genetic model for studying developmental and physiological pathways, as well as human diseases, their use in analyzing the molecular effects of substance exposure remains limited. In this study, we present a highly efficient injection method for Drosophila first- and second-instar larvae. Despite causing a slight developmental delay, this method achieves a high survival rate and offers a quick, easily adjustable protocol. The process requires 3–5 h to inject 150–300 larvae, depending on the microcapillary needle, microinjection system, and the compound being administered. As proof of concept, we compared the effects of injecting ferritin protein into Fer1HCH00451 mutant first instar larvae with those of dietary ferritin administration. Our results show that ferritin injection rescues Fer1HCH mutants, a result that cannot be achieved through dietary delivery. This approach is particularly valuable for the delivery of complex compounds in cases where oral administration is impaired or limited by the digestive system.