Protein poly-ADP-ribosylation (PARylation) is a post-translational modification formed by transfer of successive units of ADP-ribose to target proteins to form poly-ADP-ribose (PAR) chains. PAR plays a critical role in the DNA damage response (DDR) by acting as a signaling platform to promote the recruitment of DNA repair factors to the sites of DNA damage that bind via their PAR-binding domains (PBDs). Several classes of PBD families have been recognized, which identify distinct parts of the PAR chain. Proteins encoding PBDs play an essential role in conveying the PAR-mediated signal through their interaction with PAR chains, which mediates many cellular functions, including the DDR. The WWE domain identifies the iso-ADP-ribose moiety of the PAR chain. We recently described the WWE domain of RNF146 as a robust genetically encoded probe, when fused to EGFP, for detection of PAR in live cells. Here, we evaluated other PBD candidates as molecular PAR probes in live cells, including several other WWE domains and an engineered macrodomain. In addition, we demonstrate unique PAR dynamics when tracked by different PAR binding domains, a finding that that can be exploited for modulation of the PAR-dependent DNA damage response.

DNA repair defects have been increasingly focused on as therapeutic targets. In hormone positive breast cancer, XRCC1-deficient tumors have been identified and proposed as targets for combination therapies that damage DNA and inhibit DNA repair pathways. XRCC1 is a scaffold protein that functions in base excision repair (BER) by mediating essential interactions between DNA glycosylases, AP endonuclease, poly(ADP-ribose) polymerase 1, DNA polymerase β (POL β), and DNA ligases. Loss of XRCC1 confers BER defects and hypersensitivity to DNA damaging agents. BER defects have not been evaluated in triple negative breast cancer (TNBC), for which new therapeutic targets and therapies are needed. To evaluate the potential of XRCC1 as an indicator of BER defects in TNBC, we examined XRCC1 expression and localization in the TCGA database and in TNBC cell lines. High XRCC1 expression was observed for TNBC tumors in the TCGA database and expression of XRCC1 varied between TNBC cell lines. We also observed changes in XRCC1 subcellular localization in TNBCs that alter the ability to repair base lesions and single-strand breaks. Subcellular localization changes were also observed for POL β that did not correlate with XRCC1 localization. Basal levels of DNA damage were also measured in the TNBC cell lines, and damage levels correlated with observed changes in XRCC1 expression, localization, and repair functions. The results confirmed that XRCC1 expression changes may indicate DNA repair capacity changes but emphasize that basal DNA damage levels along with expression and localization are better indicators of DNA repair defects. Given the observed over-expression of XRCC1 in TNBC preclinical models and the TCGA database, XRCC1 expression levels should be considered when evaluating treatment responses of TNBC preclinical model cells.

The multitude of DNA lesion types, and the nuclear dynamic context in which they occur, present a challenge for genome integrity maintenance as this requires the engagement of different DNA repair pathways. Specific 'repair controllers' that facilitate DNA repair pathway crosstalk between double strand break (DSB) repair and base excision repair (BER), and regulate BER protein trafficking at lesion sites, have yet to be identified. We find that DNA polymerase β (Polβ), crucial for BER, is ubiquitylated in a BER complex-dependent manner by TRIP12, an E3 ligase that partners with UBR5 and restrains DSB repair signaling. Here we find that, TRIP12, but not UBR5, controls cellular levels and chromatin loading of Polβ. Required for Polβ foci formation, TRIP12 regulates Polβ involvement after DNA damage. Notably, excessive TRIP12-mediated shuttling of Polβ affects DSB formation and radiation sensitivity, underscoring its precedence for BER. We conclude that the herein discovered trafficking function at the nexus of DNA repair signaling pathways, towards Polβ-directed BER, optimizes DNA repair pathway choice at complex lesion sites.

SUMMARY Assembly and disassembly of DNA repair protein complexes at sites of DNA damage is essential to maintain genomic integrity. We investigated factors coordinating assembly of the base excision repair (BER) proteins, DNA polymerase β (Polβ) and XRCC1, to DNA lesion sites, identifying a new role for Polβ in regulating XRCC1 disassembly from DNA repair complexes and conversely, demonstrating Polβ’s dependence on XRCC1 for complex assembly. RealPAR, a genetically-encoded probe for live cell imaging of poly(ADP-ribose) (PAR), reveals that Polβ and XRCC1 require PAR for repair complex assembly and PAR degradation for disassembly. We find that BER complex assembly is further modulated by attenuation / augmentation of NAD + biosynthesis. Finally, SIRT6 does not regulate PARP1 activation but impairs XRCC1 recruitment, leading to diminished Polβ abundance at sites of DNA damage. These findings highlight coordinated yet independent roles for both PARP1 and SIRT6 and their regulation by NAD + bioavailability to facilitate BER.

Mutations in isocitrate dehydrogenase isoform 1 (IDH1) are primarily found in secondary glioblastoma (GBM) and low-grade glioma but are rare in primary GBM. The standard treatment for GBM includes radiation combined with temozolomide, an alkylating agent. Fortunately, IDH1 mutant gliomas are sensitive to this treatment, resulting in a more favorable prognosis. However, it's estimated that up to 75% of IDH1 mutant gliomas will progress to WHO grade IV over time and develop resistance to alkylating agents. Therefore, understanding the mechanism(s) by which IDH1 mutant gliomas confer sensitivity to alkylating agents is crucial for developing targeted chemotherapeutic approaches. The base excision repair (BER) pathway is responsible for repairing most base damage induced by alkylating agents. Defects in this pathway can lead to hypersensitivity to these agents due to unresolved DNA damage. The coordinated assembly and disassembly of BER protein complexes are essential for cell survival and for maintaining genomic integrity following alkylating agent exposure. These complexes rely on poly-ADP-ribose formation, an NAD+-dependent post-translational modification synthesized by PARP1 and PARP2 during the BER process. At the lesion site, poly-ADP-ribose facilitates the recruitment of XRCC1. This scaffold protein helps assemble BER proteins like DNA polymerase beta (Polβ), a bifunctional DNA polymerase containing both DNA synthesis and 5'-deoxyribose-phosphate lyase (5'dRP lyase) activity. Here, we confirm that IDH1 mutant glioma cells have defective NAD+ metabolism, but still produce sufficient nuclear NAD+ for robust PARP1 activation and BER complex formation in response to DNA damage. However, the overproduction of 2-hydroxyglutarate, an oncometabolite produced by the IDH1 R132H mutant protein, suppresses BER capacity by reducing Polβ protein levels. This defines a novel mechanism by which the IDH1 mutation in gliomas confers cellular sensitivity to alkylating agents and to inhibitors of the poly-ADP-ribose glycohydrolase, PARG.