The nuclear factor κB (NF-κB) transcription factor regulates cellular stress responses and the immune response to infection. NF-κB activation results in oscillations in nuclear NF-κB abundance. To define the function of these oscillations, we treated cells with repeated short pulses of tumor necrosis factor–α at various intervals to mimic pulsatile inflammatory signals. At all pulse intervals that were analyzed, we observed synchronous cycles of NF-κB nuclear translocation. Lower frequency stimulations gave repeated full-amplitude translocations, whereas higher frequency pulses gave reduced translocation, indicating a failure to reset. Deterministic and stochastic mathematical models predicted how negative feedback loops regulate both the resetting of the system and cellular heterogeneity. Altering the stimulation intervals gave different patterns of NF-κB–dependent gene expression, which supports the idea that oscillation frequency has a functional role.

Abstract Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) inhibit cyclooxygenase-1 (COX-1) and COX-2 enzymes. The NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex responsible for the processing of the proinflammatory cytokine interleukin-1β and is implicated in many inflammatory diseases. Here we show that several clinically approved and widely used NSAIDs of the fenamate class are effective and selective inhibitors of the NLRP3 inflammasome via inhibition of the volume-regulated anion channel in macrophages, independently of COX enzymes. Flufenamic acid and mefenamic acid are efficacious in NLRP3-dependent rodent models of inflammation in air pouch and peritoneum. We also show therapeutic effects of fenamates using a model of amyloid beta induced memory loss and a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. These data suggest that fenamate NSAIDs could be repurposed as NLRP3 inflammasome inhibitors and Alzheimer’s disease therapeutics.

Abstract Immune cells fine tune their responses to infection and inflammatory cues. Here, using live-cell confocal microscopy and mathematical modelling, we investigate interferon induced JAK-STAT signalling in innate immune macrophages. We demonstrate that transient exposure to IFN-γ stimulation induces a long-term desensitisation of STAT1 signalling and gene expression responses, revealing a dose- and time-dependent regulatory feedback that controls JAK-STAT responses upon re-exposure to stimulus. We show that IFN-α/β1 elicit different level of desensitisation from IFN-γ, where cells refractory to IFN-α/β1 are sensitive to IFN-γ, but not vice versa . We experimentally demonstrate that the underlying feedback mechanism involves regulation of STAT1 phosphorylation but is independent of new mRNA synthesis and cognate receptor expression. A new feedback model of the protein tyrosine phosphatase activity recapitulates experimental data and demonstrates JAK-STAT network’s ability to decode relative changes of dose, timing, and type of temporal interferon stimulation. These findings reveal that STAT desensitisation renders cells with signalling memory of type I and II interferon stimulation, which in the future may improve administration of interferon therapy.

Abstract Ability to adapt to temperature changes trough the Heat Shock Response (HSR) pathways is one of the most fundamental and clinically relevant cellular response systems. Here we report that Heat Shock (HS) induces a temporally-coordinated and stimulus-specific adaptation of the signalling and gene expression responses of the Nuclear Factor κB (NF-κB) transcription factor. We show that exposure of MCF7 breast adenocarcinoma cells to 43°C 1h HS inhibits the immediate signalling response to pro-inflammatory Interleukin 1β (IL1β) and Tumour Necrosis Factor α (TNFα) cytokines. Within 4h after HS treatment IL1β-induced responses return to normal levels, but the recovery of the TNFα-induced responses is delayed. Using siRNA knock-down of Heat Shock Factor 1 and mathematical modelling we show that the stimulus-specificity is conferred via the Inhibitory κB kinase signalosome, with HSR differentially controlling individual cytokine transduction pathways. Finally, using a novel mathematical model we predict and experimentally validate that the HSR cross-talk confers differential cytokine sensitivity of the NF-κB system to a range of physiological and clinically-relevant temperatures. This quantitative understanding of NF-κB and HSR cross-talk mechanisms is fundamentally important for the potential improvement of current hyperthermia protocols.

Abstract NF2 -related Schwannomatosis ( NF2 SWN) is a rare tumour-predisposition syndrome characterised by the growth of multiple central and peripheral nervous system neoplasms. The drivers of NF2 SWN are pathogenic variants in the tumour suppressor gene NF2 , encoding the protein Merlin, leading to development of bilateral vestibular schwannoma (VS) in >95% of patients. VS tumours are characterised by infiltration of myeloid cells and lymphocytes, highlighting the potential of immunotherapy for VS. However, the immunological landscape in VS and the spatial determinants within the tumour microenvironment that shape the trajectory of disease are presently unknown. In this study, to elucidate the complex immunological networks across VS, we performed imaging mass cytometry (IMC) on clinically annotated VS samples from NF2 SWN patients. We reveal the heterogeneity in neoplastic cell, myeloid cell and T cell populations that co-exist within VS, determining that the cellular composition of VS tumours is independent of NF2 -SWN genetic severity. We show that distinct myeloid cell and Schwann cell populations exist within varied spatial contextures across characteristic Antoni A and B histomorphic niches. Interestingly, we show that T-cell populations associate with tumour-associated macrophages (TAMs) in Antoni A regions, seemingly limiting their ability to interact with tumorigenic Schwann cells. This spatial landscape is altered in Antoni B regions, where T-cell populations appear to interact with PD-L1+ Schwann cells. We also demonstrate that prior bevacizumab treatment (VEGF-A antagonist) preferentially reduces alternatively-activated TAMs, whilst enhancing CD44 expression, in bevacizumab-treated tumours. Together, we describe niche-dependent modes of T-cell regulation in NF2 SWN VS, indicating the potential for microenvironment-altering therapies for VS. Teaser Imaging mass cytometry and spatial omic analyses illustrate spatially-distinct regions of T-cell regulation in vestibular schwannoma.

Mutagenesis is responsive to many environmental factors. Evolution therefore depends on the environment not only for selection but also in determining the variation available in a population. One such environmental dependency is the inverse relationship between mutation rates and population density in many microbial species. Here we determine the mechanism responsible for this mutation rate plasticity. Using dynamical computational modelling and in vivo mutation rate estimation we show that the negative relationship between mutation rate and population density arises from the collective ability of microbial populations to control concentrations of hydrogen peroxide. We demonstrate a loss of this density-associated mutation rate plasticity when Escherichia coli populations are deficient in the degradation of hydrogen peroxide. We further show that the reduction in mutation rate in denser populations is restored in peroxide degradation-deficient cells by the presence of wild-type cells in a mixed population. Together, these model-guided experiments provide a mechanistic explanation for density-associated mutation rate plasticity, applicable across all domains of life, and frames mutation rate as a dynamic trait shaped by microbial community composition.

Abstract Transcription of almost all mammalian genes occurs in stochastic bursts, however the fundamental control mechanisms that allow appropriate single-cell responses remain unresolved. Here we utilise single cell genomics data and stochastic models of transcription to perform global analysis of the toll-like receptor (TLR)-induced gene expression variability. Based on analysis of more than 2000 TLR-response genes across multiple experimental conditions we demonstrate that the single-cell, gene-by-gene expression variability can be empirically described by a linear function of the population mean. We show that response heterogeneity of individual genes can be characterised by the slope of the mean-variance line, which captures how cells respond to stimulus and provides insight into evolutionary differences between species. We further demonstrate that linear relationships theoretically determine the underlying transcriptional bursting kinetics, revealing different regulatory modes of TLR response heterogeneity. Stochastic modelling of temporal scRNA-seq count distributions demonstrates that increased response variability is associated with larger and more frequent transcriptional bursts, which emerge via increased complexity of transcriptional regulatory networks between genes and different species. Overall, we provide a methodology relying on inference of empirical mean-variance relationships from single cell data and new insights into control of innate immune response variability.

Abstract Cells respond to inflammatory stimuli such as cytokines by activation of the nuclear factor-κB (NF-κB) signalling pathway, resulting in oscillatory translocation of the transcription factor p65 between nucleus and cytoplasm to mediate immune response. We investigate the relationship between p65 and inhibitor-κBα (IκBα) protein levels and dynamic properties of the system, and how this interaction impacts on the expression of key inflammatory genes. Using bacterial artificial chromosomes, we developed new cell models of IκBα-eGFP protein overexpression in a native genomic context. We find that cells with high levels of the negative regulator IκBα remain responsive to inflammatory stimuli and maintain dynamics for both p65 and IκBα. In contrast, canonical target gene expression is dramatically reduced by overexpression of IκBα, but can be partially rescued by overexpression of p65. Treatment with leptomycin B to promote nuclear accumulation of IκBα also suppresses canonical target gene expression, suggesting a mechanism in which nuclear IκBα accumulation prevents productive p65 interaction with promoter binding sites. This causes reduced target promoter binding and gene transcription, which we validate by chromatin immune precipitation and in primary cells. Overall, we show how inflammatory gene transcription is modulated by the expression levels of both IκBα and p65, and that transcription can be partially decoupled from p65 protein dynamics. This results in an anti-inflammatory effect on transcription, demonstrating a broad mechanism to modulate the strength of inflammatory response.

Abstract Pathogens have developed intricate strategies to overcome the host’s innate immune responses. In this paper we use live-cell microscopy with a single bacterium resolution to follow in real time interactions between the food-borne pathogen L. monocytogenes and host macrophages, a key event controlling the infection in vivo . We demonstrate that infection results in heterogeneous outcomes, with only a subset of bacteria able to establish a replicative invasion of macrophages. The fate of individual bacteria in the same host cell was independent from each other and non-cooperative, but a higher multiplicity of infection resulted in a reduced probability of replication. Using internalisation assays and conditional probabilities to mathematically describe the multi-stage invasion process, we demonstrate that the secreted Listeriolysin toxin (LLO) of the PrfA regulon regulates replication probability by compromising the ability to phagocytose bacteria. Using strains expressing fluorescent reporters to follow transcription of either the LLO-encoding hly or actA genes, we show that replicative bacteria exhibited higher PrfA regulon expression in comparison to those bacteria that did not replicate, however elevated PrfA expression per se was not sufficient to increase the probability of replication. Overall, this demonstrates a new role for the population-level, but not single cell PrfA-mediated cooperativity to regulate outcomes of host pathogen interactions. Key points L. monocytogenes invasion of innate immune macrophages results in heterogeneous infection outcomes at the single cell level Fate of individual bacteria in the same host cell is independent from each other and non-cooperative Bacterial populations coordinate host cell uptake via the rate of phagocytosis to reduce internalization at high MOI The PrfA regulon system is necessary but not sufficient for L. monocytogenes replication, but population-level PrfA virulence regulates single cell outcome probability

Abstract The heterogeneous nature of inflammatory bowel disease (IBD) presents challenges, particularly when choosing therapy. Activation of the NF-kappa B transcription factor is a highly-regulated, dynamic event in IBD pathogenesis. We expressed the human NF-kappa B/p65 subunit in blood-derived macrophages, using lentivirus. Confocal imaging of p65 activation revealed that a higher proportion of macrophages from Crohn's patients responded to lipid-A compared to controls. In contrast, cells from ulcerative colitis (UC) patients exhibited a shorter duration of p65 nuclear localisation compared to healthy controls and Crohn's donors. Using a similar lentivirus approach, NF-kappa B-regulated luciferase was expressed in patient macrophages, isolated from frozen peripheral blood mononuclear cell samples. Following activation, samples could be segregated into three clusters based on the NF-kappa B-regulated luciferase response. The majority of UC samples appeared in hypo-responsive cluster 1, with Crohn's patients representing the majority of hyper-responsive cluster 3. A positive correlation was seen between NF-kappa B-induced luciferase activity and cytokine levels released to medium from stimulated macrophages, but not in serum or biopsy. Analysis of macrophage cytokine responses and patient metadata revealed a strong correlation between Crohn's patients who smoked and hyper-activation of p65. These in vitro dynamic assays of NF-kappa B activation in blood-derived macrophages segregate IBD patients into groups with different phenotypes and therefore may help determine response to therapy.