Abstract In viruses and cells, DNA is closely packed and tightly curved thanks to polyvalent cations inducing an effective attraction between its negatively charged filaments. Our understanding of this effective attraction remains very incomplete, partly because experimental data is limited to bulk measurements on large samples of mostly uncurved DNA helices. Here we use cryo electron microscopy to shed light on the interaction between highly curved helices. We find that the spacing between DNA helices in spermine-induced DNA toroidal condensates depends on their location within the torus, consistent with a mathematical model based on the competition between electrostatic interactions and the bending rigidity of DNA. We use our model to infer the characteristics of the interaction potential, and find that its equilibrium spacing strongly depends on the curvature of the filaments. In addition, the interaction is much softer than previously reported in bulk samples using different salt conditions. Beyond viruses and cells, our characterization of the interactions governing DNA-based dense structures could help develop robust designs in DNA nanotechnologies.

Networks of intermediate filaments (IFs) need to constantly reorganize to fulfil their functions at different locations within the cell. The mechanism of IF assembly is well described and involves filament end-to-end annealing. By contrast, the mechanisms involved in IF disassembly are far less understood. In vitro , IFs are assumed to be very stable and their disassembly negligible. IF fragmentation has been observed in many cell types, but it has been suggested to be associated with active processes such as IF post-translational modifications. In this article, we uncover the contribution of filament spontaneous fragmentation in the assembly dynamics of type III vimentin IF using a combination of in vitro reconstitution probed by fluorescence imaging and theoretical modeling. We first show that vimentin assembly at low concentrations results in an equilibrium between filament annealing and fragmentation at times ≥24 hours. At higher concentrations, entanglements kinetically trap the system out of equilibrium, and we show that this trapping is reversible upon dilution. Taking into account both fragmentation and entanglement, we estimate that the mean bond breaking time is ∼18 hours. This translates into a mean breaking time of ∼ 5 hours for a 1 μm long filament, which is a relevant time scale for IF reorganization in live cells. Finally, we provide direct evidence through dual-color imaging that filament fragmentation and annealing coexist during assembly. By showing that IF fragmentation can occur without cofactors or post-translational modifications, our study provides new insights into the physical understanding of the IF length regulation.

Glioblastomas (GBMs) are dreadful brain tumors with abysmal survival outcomes. GBM EVs dramatically affect normal brain cells (largely astrocytes) constituting the tumor microenvironment (TME). EVs from different patient-derived GBM spheroids induced differential transcriptomic, secretomic, and proteomic effects on cultured astrocytes/brain tissue slices as GBM EV recipients. The net outcome of brain cell differential changes nonetheless converges on increased tumorigenicity. GBM spheroids and brain slices were derived from neurosurgical patient tissues following informed consent. Astrocytes were commercially obtained. EVs were isolated from conditioned culture media by ultrafiltration, ultraconcentration, and ultracentrifugation. EVs were characterized by nanoparticle tracking analysis, electron microscopy, biochemical markers, and proteomics. Astrocytes/brain tissues were treated with GBM EVs before downstream analyses. EVs from different GBMs induced brain cells to alter secretomes with pro-inflammatory or TME-modifying (proteolytic) effects. Astrocyte responses ranged from anti-viral gene/protein expression and cytokine release to altered extracellular signal-regulated protein kinase (ERK1/2) signaling pathways, and conditioned media from EV-treated cells increased GBM cell proliferation. Thus, astrocytes/brain slices treated with different GBM EVs underwent non-identical changes in various 'omics readouts and other assays, indicating "personalized" tumor-specific GBM EV effects on the TME. This raises concern regarding reliance on "model" systems as a sole basis for translational direction. Nonetheless, net downstream impacts from differential cellular and TME effects still led to increased tumorigenic capacities for the different GBMs.

The actin cytoskeleton shapes cells and also organizes internal membranous compartments. In particular, it interacts with membranes in intracellular transport of material in mammalian cells, yeast or plant cells. Tubular membrane intermediates, pulled along microtubule tracks, are involved during these processes, and destabilize into vesicles. While the role of actin in this destabilization process is still debated, literature also provide examples of membranous structures stabilization by actin. To directly address this apparent contradiction, we mimic the geometry of tubular intermediates with preformed membrane tubes. The growth of an actin sleeve at the tube surface is monitored spatio-temporally. Depending on network cohesiveness, actin is able to stabilize, or maintain membrane tubes under pulling. Indeed, on a single tube, thicker portions correlate with the presence of actin. Such structures relax over several minutes, and may provide enough time and curvature geometries for other proteins to act on tube stability.

ABSTRACT During osmotic changes of their environment, cells actively regulate their volume and plasma membrane tension that can passively change through osmosis. How tension and volume are coupled during osmotic adaptation remains unknown, as a quantitative characterization is lacking. Here, we performed dynamic membrane tension and cell volume measurements during osmotic shocks. During the first few seconds following the shock, cell volume varied to equilibrate osmotic pressures inside and outside the cell, and membrane tension dynamically followed these changes. A theoretical model based on the passive, reversible unfolding of the membrane as it detaches from the actin cortex during volume increase, quantitatively describes our data. After the initial response, tension and volume recovered from hypoosmotic shocks but not from hyperosmotic shocks. During these asymmetric recoveries, tension and volume remained coupled. Pharmacological disruption of the cytoskeleton and functional inhibition of ion channels and mTOR all affected tension and volume responses, proving that a passive mechanism is necessary and critical for the cell to adapt fast. The coupling between them was, nonetheless, maintained for a few exceptions suggesting that volume and tension regulations are independent from the regulation of their coupling.

Intermediate filaments are key regulators of cell mechanics. Vimentin, a type of intermediate filament expressed in mesenchymal cells and involved in migration, forms a dense network in the cytoplasm that is constantly remodeled through filament transport, elongation/shortening, and subunit exchange. While it is known that filament elongation involves end-to-end annealing, it is unclear how the reverse process of filament shortening by fragmentation occurs. Here, we use a combination of \textit{in vitro} reconstitution probed by fluorescence imaging and theoretical modeling to uncover the molecular mechanism involved in filament breakage. We first show that vimentin filaments are composed of two layers of subunits, half of which are exchangeable and half of which are immobile. We also show that the exchangeable subunits are tetramers. We further reveal a mechanism of continuous filament self-repair in which a soluble pool of vimentin tetramers in equilibrium with the filaments is essential to maintain filament integrity. Filaments break as a consequence of local fluctuations in the number of subunits per cross-section induced by the constant subunit exchange of tetramers. We determine that a filament tends to break if about four tetramers are removed from the same filament cross-section. Finally, we analyze the dynamics of association/dissociation and fragmentation to estimate the binding energy of a tetramer to a complete versus a partially disassembled filament. Our results provide a comprehensive description of vimentin turnover and reveal the link between subunit exchange and fragmentation.

ESCRT-III proteins assemble into ubiquitous membrane-remodeling polymers during many cellular processes. Here we describe the structure of helical membrane tubes that are scaffolded by bundled ESCRT-III filaments. Cryo-ET reveals how the shape of the helical membrane tube arises from the assembly of distinct bundles of protein filaments that bind the membrane with different mean curvatures. Cryo-EM reveals how one of these ESCRT-III filaments engages the membrane tube through a novel interface. Mathematical modeling of the helical membrane tube suggests how its shape emerges from differences in membrane binding energy, positional rigidity, and membrane tension. Altogether, our findings support a model in which increasing the rigidity of ESCRT-III filaments through the assembly of multi-strands triggers buckling of the membrane.

Abstract Study question Can we measure the mechanical properties of mammalian oocytes with AFM and use them as a biomarker to identify oocytes with the best development potential? Summary answer We characterized mammalian oocytes’ mechanical properties using AFM, correlated them with oocyte cortex organization, and explored these parameters in contexts critical for oocyte quality. What is known already Oocyte production is crucial for reproduction but prone to errors, yielding a significant number of poor-quality oocytes detrimental to fertility and offspring development. Indeed, oocyte quality determines embryo health post-fertilization. Current selection methods for oocytes rely on subjective morphological analyses. Remarkably, human and mouse oocyte quality correlates with mechanical properties, particularly cortical tension (CT). CT defects in oocytes are rather frequent and impair early embryonic development after fertilization. However, they do not induce any visible oocyte morphological alteration. Mechanical properties could, therefore, be used as a biomarker of oocyte quality. Study design, size, duration We designed an AFM protocol for the measurement and analysis of mammalian oocytes’ mechanical properties, including a new elasto-capillary model describing oocyte mechanics. Concomitantly, we analyzed oocyte cortex organization using spinning disk microscopy in live. We measured mouse oocytes at various stages of meiotic maturation (prophaseI, meiosisI, meiosisII), mutant mouse oocytes with known cortical tension defects, oocytes coming from young and aged mice, and human oocytes at various stages of meiotic maturation (prophaseI, meiosisI, meiosisII). Participants/materials, setting, methods Mouse oocytes were collected from 11-week-old and 44-56-week-old OF1 female mice. Human oocytes were collected from patients who underwent ovarian stimulation for Assisted Reproduction Technologies (ART) as part of their protocol. Only oocytes that were in prophaseI or meiosisI after ovarian punction and thus not suitable for the ART procedure were used in this study. All patients gave informed consent (agreement CNIL number 22_5725). Main results and the role of chance Our AFM approach allows measuring various mechanical parameters, including oocyte cortical tension, elasticity, and capillary indentation rate, quantifying whether the oocyte behaves predominantly as a droplet with surface tension or as an elastic material. We find that these parameters correlate to specific oocyte cortex organization, showing that a thin actin cortex enriched in myosin II is associated with high tension, high elastic modulus, and low capillary indentation rate. In contrast, a thick actin cortex with few myosin II is associated with low cortical tension, low elasticity, and high capillary indentation rate. We go further and show that these parameters can predict cortex organization. Indeed, oocytes from aged mice display altered mechanical parameters, reflecting specific changes in their cortex organization. Finally, we transferred our approach to human oocytes. We show that the mechanical parameters of mouse and human oocytes are in the same range. Still, in humans, they evolve differently from those of mice during meiotic maturation, again reflecting specific changes in the organization of their cortex. Thus, mechanical parameters correlate with oocytes quality, and can predict cortex organization in mouse and human. Limitations, reasons for caution AFM is hardly usable for clinical application, we are thus working in parallel on developing non-invasive devices to perform high-throughput measurements of oocyte mechanical properties in a non-invasive manner, to serve as a mechanical biomarker to identify oocytes with the best developmental potential for ART. Wider implications of the findings Ultimately, this project could improve ART procedures by increasing their success rate while decreasing treatment cycles and risks for the patient and newborn, and optimize protocols for oocyte freezing for fertility preservation. Trial registration number not applicable

Cell membrane deformations are crucial for proper cell function. Specialized protein assemblies initiate inward or outward membrane deformations that turn into, for example, filopodia or endocytic intermediates. Actin dynamics and actin-binding proteins are involved in this process, although their detailed role remains controversial. We show here that a dynamic, branched actin network is sufficient, in absence of any membrane-associated proteins, to initiate both inward and outward membrane deformation. With actin polymerization triggered at the membrane of liposomes, we produce inward filopodia-like structures at low tension, while outward endocytosis-like structures are robustly generated regardless of tension. Our results are reminiscent of endocytosis in mammalian cells, where actin polymerization forces are required when membrane tension is increased, and in yeast, where they are always required to overcome the opposing turgor pressure. By combining experimental observations with physical modeling, we propose a mechanism for actin-driven endocytosis under high tension or high pressure conditions.

Formins are major regulators of actin networks. They enhance actin filament dynamics by remaining processively bound to filament barbed ends. How biochemical and mechanical factors affect formin processivity are open questions. Monitoring individual actin filaments in a microfluidic flow, we report that formin mDia1 dissociates faster under higher ionic strength and when actin concentration is increased. Profilin, known to increase the elongation rate of formin-associated filaments, surprisingly decreases the formin dissociation rate, by bringing formin FH1 domains in transient contact with the barbed end. In contrast, piconewton tensile forces applied to actin filaments accelerate formin dissociation by orders of magnitude, largely overcoming profilin-mediated stabilization. We developed a model of formin conformations and its confrontation to our data indicates the existence of two different dissociation pathways, with force favoring one over the other. How cells limit formin dissociation under tension is now a key question for future studies.