ESCRT-III is required for lipid membrane remodeling in many cellular processes, from abscission to viral budding and multi-vesicular body biogenesis. However, how ESCRT-III polymerization generates membrane curvature remains debated. Here, we show that Snf7, the main component of ESCRT-III, polymerizes into spirals at the surface of lipid bilayers. When covering the entire membrane surface, these spirals stopped growing when densely packed: they had a polygonal shape, suggesting that lateral compression could deform them. We reasoned that Snf7 spirals could function as spiral springs. By measuring the polymerization energy and the rigidity of Snf7 filaments, we showed that they were deformed while growing in a confined area. Furthermore, we observed that the elastic expansion of compressed Snf7 spirals generated an area difference between the two sides of the membrane and thus curvature. This spring-like activity underlies the driving force by which ESCRT-III could mediate membrane deformation and fission.

Red blood cells are amazingly deformable structures able to recover their initial shape even after large deformations as when passing through tight blood capillaries. The reason for this exceptional property is found in the composition of the membrane and the membrane-cytoskeleton interaction. We investigate the mechanics and the dynamics of RBCs by a unique noninvasive technique, using weak optical tweezers to measure membrane fluctuation amplitudes with mus temporal and sub nm spatial resolution. This enhanced edge detection method allows to span over >4 orders of magnitude in frequency. Hence, we can simultaneously measure red blood cell membrane mechanical properties such as bending modulus kappa = 2.8 +/- 0.3 x 10(-19)J = 67.6 +/- 7.2 k(B)T, tension sigma = 6.5 +/- 2.1 x 10(-7)N/m, and an effective viscosity eta(eff) = 81 +/- 3.7 x 10(-3) Pa s that suggests unknown dissipative processes. We furthermore show that cell mechanics highly depends on the membrane-spectrin interaction mediated by the phosphorylation of the interconnection protein 4.1R. Inhibition and activation of this phosphorylation significantly affects tension and effective viscosity. Our results show that on short time scales (slower than 100 ms) the membrane fluctuates as in thermodynamic equilibrium. At time scales longer than 100 ms, the equilibrium description breaks down and fluctuation amplitudes are higher by 40% than predicted by the membrane equilibrium theory. Possible explanations for this discrepancy are influences of the spectrin that is not included in the membrane theory or nonequilibrium fluctuations that can be accounted for by defining a nonthermal effective energy of up to E(eff) = 1.4 +/- 0.1 k(B)T, that corresponds to an actively increased effective temperature.

The generation of membrane curvature in intracellular traffic involves many proteins that can curve lipid bilayers. Among these, dynamin-like proteins were shown to deform membranes into tubules, and thus far are the only proteins known to mechanically drive membrane fission. Because dynamin forms a helical coat circling a membrane tubule, its polymerization is thought to be responsible for this membrane deformation. Here we show that the force generated by dynamin polymerization, 18 pN, is sufficient to deform membranes yet can still be counteracted by high membrane tension. Importantly, we observe that at low dynamin concentration, polymer nucleation strongly depends on membrane curvature. This suggests that dynamin may be precisely recruited to membrane buds’ necks because of their high curvature. To understand this curvature dependence, we developed a theory based on the competition between dynamin polymerization and membrane mechanical deformation. This curvature control of dynamin polymerization is predicted for a specific range of concentrations (∼0.1–10 μM), which corresponds to our measurements. More generally, we expect that any protein that binds or self-assembles onto membranes in a curvature-coupled way should behave in a qualitatively similar manner, but with its own specific range of concentration.

Animal cells in tissues are supported by biopolymer matrices, which typically exhibit highly nonlinear mechanical properties. While the linear elasticity of the matrix can significantly impact cell mechanics and functionality, it remains largely unknown how cells, in turn, affect the nonlinear mechanics of their surrounding matrix. Here we show that living contractile cells are able to generate a massive stiffness gradient in three distinct 3D extracellular matrix model systems: collagen, fibrin, and Matrigel. We decipher this remarkable behavior by introducing Nonlinear Stress Inference Microscopy (NSIM), a novel technique to infer stress fields in a 3D matrix from nonlinear microrheology measurement with optical tweezers. Using NSIM and simulations, we reveal a long-ranged propagation of cell-generated stresses resulting from local filament buckling. This slow decay of stress gives rise to the large spatial extent of the observed cell-induced matrix stiffness gradient, which could form a mechanism for mechanical communication between cells.

In endocytosis, scaffolding is one of the mechanisms to create membrane curvature by moulding the membrane into the spherical shape of the clathrin cage. However, the impact of membrane elastic parameters on the assembly and shape of clathrin lattices has never been experimentally evaluated. Here, we show that membrane tension opposes clathrin polymerization. We reconstitute clathrin budding in vitro with giant unilamellar vesicles (GUVs), purified adaptors and clathrin. By changing the osmotic conditions, we find that clathrin coats cause extensive budding of GUVs under low membrane tension while polymerizing into shallow pits under moderate tension. High tension fully inhibits polymerization. Theoretically, we predict the tension values for which transitions between different clathrin coat shapes occur. We measure the changes in membrane tension during clathrin polymerization, and use our theoretical framework to estimate the polymerization energy from these data. Our results show that membrane tension controls clathrin-mediated budding by varying the membrane budding energy.

Abstract In viruses and cells, DNA is closely packed and tightly curved thanks to polyvalent cations inducing an effective attraction between its negatively charged filaments. Our understanding of this effective attraction remains very incomplete, partly because experimental data is limited to bulk measurements on large samples of mostly uncurved DNA helices. Here we use cryo electron microscopy to shed light on the interaction between highly curved helices. We find that the spacing between DNA helices in spermine-induced DNA toroidal condensates depends on their location within the torus, consistent with a mathematical model based on the competition between electrostatic interactions and the bending rigidity of DNA. We use our model to infer the characteristics of the interaction potential, and find that its equilibrium spacing strongly depends on the curvature of the filaments. In addition, the interaction is much softer than previously reported in bulk samples using different salt conditions. Beyond viruses and cells, our characterization of the interactions governing DNA-based dense structures could help develop robust designs in DNA nanotechnologies.

Glioblastomas (GBMs) are dreadful brain tumors with abysmal survival outcomes. GBM EVs dramatically affect normal brain cells (largely astrocytes) constituting the tumor microenvironment (TME). EVs from different patient-derived GBM spheroids induced differential transcriptomic, secretomic, and proteomic effects on cultured astrocytes/brain tissue slices as GBM EV recipients. The net outcome of brain cell differential changes nonetheless converges on increased tumorigenicity. GBM spheroids and brain slices were derived from neurosurgical patient tissues following informed consent. Astrocytes were commercially obtained. EVs were isolated from conditioned culture media by ultrafiltration, ultraconcentration, and ultracentrifugation. EVs were characterized by nanoparticle tracking analysis, electron microscopy, biochemical markers, and proteomics. Astrocytes/brain tissues were treated with GBM EVs before downstream analyses. EVs from different GBMs induced brain cells to alter secretomes with pro-inflammatory or TME-modifying (proteolytic) effects. Astrocyte responses ranged from anti-viral gene/protein expression and cytokine release to altered extracellular signal-regulated protein kinase (ERK1/2) signaling pathways, and conditioned media from EV-treated cells increased GBM cell proliferation. Thus, astrocytes/brain slices treated with different GBM EVs underwent non-identical changes in various 'omics readouts and other assays, indicating "personalized" tumor-specific GBM EV effects on the TME. This raises concern regarding reliance on "model" systems as a sole basis for translational direction. Nonetheless, net downstream impacts from differential cellular and TME effects still led to increased tumorigenic capacities for the different GBMs.

Networks of intermediate filaments (IFs) need to constantly reorganize to fulfil their functions at different locations within the cell. The mechanism of IF assembly is well described and involves filament end-to-end annealing. By contrast, the mechanisms involved in IF disassembly are far less understood. In vitro , IFs are assumed to be very stable and their disassembly negligible. IF fragmentation has been observed in many cell types, but it has been suggested to be associated with active processes such as IF post-translational modifications. In this article, we uncover the contribution of filament spontaneous fragmentation in the assembly dynamics of type III vimentin IF using a combination of in vitro reconstitution probed by fluorescence imaging and theoretical modeling. We first show that vimentin assembly at low concentrations results in an equilibrium between filament annealing and fragmentation at times ≥24 hours. At higher concentrations, entanglements kinetically trap the system out of equilibrium, and we show that this trapping is reversible upon dilution. Taking into account both fragmentation and entanglement, we estimate that the mean bond breaking time is ∼18 hours. This translates into a mean breaking time of ∼ 5 hours for a 1 μm long filament, which is a relevant time scale for IF reorganization in live cells. Finally, we provide direct evidence through dual-color imaging that filament fragmentation and annealing coexist during assembly. By showing that IF fragmentation can occur without cofactors or post-translational modifications, our study provides new insights into the physical understanding of the IF length regulation.

ESCRT-III proteins assemble into ubiquitous membrane-remodeling polymers during many cellular processes. Here we describe the structure of helical membrane tubes that are scaffolded by bundled ESCRT-III filaments. Cryo-ET reveals how the shape of the helical membrane tube arises from the assembly of distinct bundles of protein filaments that bind the membrane with different mean curvatures. Cryo-EM reveals how one of these ESCRT-III filaments engages the membrane tube through a novel interface. Mathematical modeling of the helical membrane tube suggests how its shape emerges from differences in membrane binding energy, positional rigidity, and membrane tension. Altogether, our findings support a model in which increasing the rigidity of ESCRT-III filaments through the assembly of multi-strands triggers buckling of the membrane.

Intermediate filaments are key regulators of cell mechanics. Vimentin, a type of intermediate filament expressed in mesenchymal cells and involved in migration, forms a dense network in the cytoplasm that is constantly remodeled through filament transport, elongation/shortening, and subunit exchange. While it is known that filament elongation involves end-to-end annealing, it is unclear how the reverse process of filament shortening by fragmentation occurs. Here, we use a combination of \textit{in vitro} reconstitution probed by fluorescence imaging and theoretical modeling to uncover the molecular mechanism involved in filament breakage. We first show that vimentin filaments are composed of two layers of subunits, half of which are exchangeable and half of which are immobile. We also show that the exchangeable subunits are tetramers. We further reveal a mechanism of continuous filament self-repair in which a soluble pool of vimentin tetramers in equilibrium with the filaments is essential to maintain filament integrity. Filaments break as a consequence of local fluctuations in the number of subunits per cross-section induced by the constant subunit exchange of tetramers. We determine that a filament tends to break if about four tetramers are removed from the same filament cross-section. Finally, we analyze the dynamics of association/dissociation and fragmentation to estimate the binding energy of a tetramer to a complete versus a partially disassembled filament. Our results provide a comprehensive description of vimentin turnover and reveal the link between subunit exchange and fragmentation.