ABSTRACT Paired T cell receptor and RNA single cell sequencing (scTCR/RNA-seq) has allowed for enhanced resolution of clonal T cell dynamics in cancer. Here, we report a scTCR/RNA-seq dataset of 162,062 single T cells from 31 tissue regions, including tumor, adjacent normal tissues, and lymph nodes (LN), from three patients who underwent resections for progressing lung cancers after immune checkpoint blockade (ICB). We found marked regional heterogeneity in tumor persistence that was associated with heterogeneity in CD4 and CD8 T cell phenotypes; regions with persistent cancer cells were enriched for follicular helper CD4 T cells (TFH), regulatory T cells (Treg), and exhausted CD8 T cells. Clonal analysis demonstrated that highly-expanded T cell clones were predominantly of the CD8 subtype, were ubiquitously present across all sampled regions, found in the peripheral circulation, and expressed gene signatures of ‘large’ and ‘dual-expanded’ clones that have been predictive of response to ICB. Longitudinal tracking of CD8 T cell clones in the peripheral blood revealed that the persistence of ubiquitous CD8 T cell clones, as well as phenotypically distinct clones with tumor-reactive features, correlated with systemic tumor control. Finally, tracking CD8 T cell clones across tissues revealed the presence of TCF-1 + precursor exhausted CD8 T cells in tumor draining LNs that were clonally linked to expanded exhausted CD8 T cells in tumors. Altogether, this comprehensive scTCR/RNA-seq dataset with regional, longitudinal, and clonal resolution provides fundamental insights into the tissue distribution, persistence, and differentiation trajectories of ICB-responsive T cells that underlie clinical responses to ICB.

Abstract Lineage plasticity is a well–established mechanism of resistance to targeted therapies in lung and prostate cancer, where tumors transition from adenocarcinoma to small–cell or neuroendocrine carcinoma. Through single–cell analysis of a cohort of heavily–treated castration–resistant human prostate cancers (CRPC), we report a greater degree of plasticity than previously appreciated, with multiple distinct neuroendocrine (NEPC), mesenchymal (EMT–like), and other subpopulations detected within single biopsies. To explore the steps leading to this plasticity, we turned to two genetically engineered mouse models of prostate cancer that recapitulate progression from adenocarcinoma to neuroendocrine disease. Time course studies reveal expansion of stem–like luminal epithelial cells ( Sca1 +, Psca +, called L2) that, based on trajectories, gave rise to at least 4 distinct subpopulations, NEPC ( Ascl1 +), POU2F3 ( Pou2f3 +), TFF3 ( Tff3 +) and EMT–like ( Vim +, Ncam1 +)––these populations are also seen in human prostate and small cell lung cancers. Transformed L2–like cells express stem–like and gastrointestinal endoderm–like transcriptional programs, indicative of reemerging developmental plasticity programs, as well as elevated Jak/Stat and interferon pathway signaling. In sum, while the magnitude of multilineage heterogeneity, both within and across patients, raises considerable treatment challenges, the identification of highly plastic luminal cells as the likely source of this heterogeneity provides a target for more focused therapeutic intervention. One Sentence Summary Multilineage plasticity results from expansion of stem–like luminal cells with JAK/STAT activation, serving as a therapeutic target.

Targeting cell surface molecules using radioligand and antibody-based therapies has yielded considerable success across cancers. However, it remains unclear how the expression of putative lineage markers, particularly cell surface molecules, varies in the process of lineage plasticity, wherein tumor cells alter their identity and acquire new oncogenic properties. A notable example of lineage plasticity is the transformation of prostate adenocarcinoma (PRAD) to neuroendocrine prostate cancer (NEPC)—a growing resistance mechanism that results in the loss of responsiveness to androgen blockade and portends dismal patient survival. To understand how lineage markers vary across the evolution of lineage plasticity in prostate cancer, we applied single-cell analyses to 21 human prostate tumor biopsies and two genetically engineered mouse models, together with tissue microarray analysis on 131 tumor samples. Not only did we observe a higher degree of phenotypic heterogeneity in castrate-resistant PRAD and NEPC than previously anticipated but also found that the expression of molecules targeted therapeutically, namely PSMA , STEAP1 , STEAP2 , TROP2, CEACAM5 , and DLL3 , varied within a subset of gene-regulatory networks (GRNs). We also noted that NEPC and small cell lung cancer subtypes shared a set of GRNs, indicative of conserved biologic pathways that may be exploited therapeutically across tumor types. While this extreme level of transcriptional heterogeneity, particularly in cell surface marker expression, may mitigate the durability of clinical responses to current and future antigen-directed therapies, its delineation may yield signatures for patient selection in clinical trials, potentially across distinct cancer types.

Abstract The inherent plasticity of tumor cells provides a mechanism of resistance to many molecularly targeted therapies, exemplified by adeno-to-neuroendocrine lineage transitions seen in prostate and lung cancer. Here we investigate the root cause of this lineage plasticity in a primary murine prostate organoid model that mirrors the lineage transition seen in patients. These cells lose luminal identity within weeks following deletion of Trp53 and Rb1 , ultimately acquiring an Ar-negative, Syp+ phenotype after orthotopic in vivo transplantation. Single-cell transcriptomic analysis revealed progressive mixing of luminal-basal lineage features after tumor suppressor gene deletion, accompanied by activation of Jak/Stat and Fgfr pathway signaling and interferon-a and -g gene expression programs prior to any morphologic changes. Genetic or pharmacologic inhibition of Jak1/2 in combination with FGFR blockade restored luminal differentiation and sensitivity to antiandrogen therapy in models with residual AR expression. Collectively, we show lineage plasticity initiates quickly as a largely cell-autonomous process and, through newly developed computational approaches, identify a pharmacological strategy that restores lineage identity using clinical grade inhibitors.

ABSTRACT The repertoire of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can be vast, and many of these TILs are not endowed with tumor reactivity. While a number of reports have shown that tumor-reactive TILs express CD39, few reports have demonstrated that conversely, CD39 can be leveraged to serve as a proxy of tumor-reactive CD8 T cells. Using single-cell CITE/RNA/TCRseq, we show that CD39 + CD8 T cells in human lung cancers demonstrate transcriptional and proteomic features of exhaustion, tumor reactivity, and clonal expansion. Moreover, TCR cloning revealed that CD39 enriched for tumor-reactive CD8 T cell clones. Flow cytometry of 440 lung cancer specimens revealed that CD39 level on CD8 T cells is only weakly correlated with tumoral features that currently guide lung cancer therapy, such as histology, driver mutation, PD-L1 and tumor mutation burden. PD-1 axis blockade, but not cytotoxic chemotherapy, increased intratumoral CD39 + CD8 T cells. CD39 correlated with PD-1 expression on CD8 T cells and high pre-treatment/early-on-treatment levels were associated with improved clinical outcomes, but not immune-related adverse events, from immune checkpoint blockade therapy. This comprehensive profiling of the clinical, pathological and molecular features highlights the utility of CD39 as a proxy for tumor-reactive CD8 T cells in human lung cancer.

ABSTRACT Small cell lung cancer (SCLC) is an aggressive malignancy that includes subtypes defined by differential expression of ASCL1 , NEUROD1 , and POU2F3 (SCLC-A, -N, and -P, respectively), which are associated with distinct therapeutic vulnerabilities. To define the heterogeneity of tumors and their associated microenvironments across subtypes, we sequenced 54,523 cellular transcriptomes from 21 human biospecimens. Our single-cell SCLC atlas reveals tumor diversity exceeding lung adenocarcinoma, driven by canonical, intermediate, and admixed subtypes. We discovered a PLCG2 -high tumor cell population with stem-like, pro-metastatic features that recurs across subtypes and predicts worse overall survival, and manipulation of PLCG2 expression in cells confirms correlation with key metastatic markers. Treatment and subtype are associated with substantial phenotypic changes in the SCLC immune microenvironment, with greater T-cell dysfunction in SCLC-N than SCLC-A. Moreover, the recurrent, PLCG2- high subclone is associated with exhausted CD8+ T-cells and a pro-fibrotic, immunosuppressive monocyte/macrophage population, suggesting possible tumor-immune coordination to promote metastasis.

The mechanisms underlying immune evasion and immunotherapy resistance in small cell lung cancer (SCLC) remain unclear. Herein, we investigate the role of CRACD tumor suppressor in SCLC. We found that CRACD is frequently inactivated in SCLC, and Cracd knockout (KO) significantly accelerates SCLC development driven by loss of Rb1, Trp53, and Rbl2. Notably, the Cracd-deficient SCLC tumors display CD8+ T cell depletion and suppression of antigen presentation pathway. Mechanistically, CRACD loss silences the MHC-I pathway through EZH2. EZH2 blockade is sufficient to restore the MHC-I pathway and inhibit CRACD loss-associated SCLC tumorigenesis. Unsupervised single-cell transcriptomic analysis identifies SCLC patient tumors with concomitant inactivation of CRACD, impairment of tumor antigen presentation, and downregulation of EZH2 target genes. Our findings define CRACD loss as a new molecular signature associated with immune evasion of SCLC cells and proposed EZH2 blockade as a viable option for CRACD-negative SCLC treatment.

Targeting cell surface molecules using radioligand and antibody-based therapies has yielded considerable success across cancers. However, it remains unclear how the expression of putative lineage markers, particularly cell surface molecules, varies in the process of lineage plasticity, wherein tumor cells alter their identity and acquire new oncogenic properties. A notable example of lineage plasticity is the transformation of prostate adenocarcinoma (PRAD) to neuroendocrine prostate cancer (NEPC)--a growing resistance mechanism that results in the loss of responsiveness to androgen blockade and portends dismal patient survival. To understand how lineage markers vary across the evolution of lineage plasticity in prostate cancer, we applied single cell analyses to 21 human prostate tumor biopsies and two genetically engineered mouse models, together with tissue microarray analysis (TMA) on 131 tumor samples. Not only did we observe a higher degree of phenotypic heterogeneity in castrate-resistant PRAD and NEPC than previously anticipated, but also found that the expression of molecules targeted therapeutically, namely PSMA , STEAP1 , STEAP2 , TROP2, CEACAM5 , and DLL3 , varied within a subset of gene-regulatory networks (GRNs). We also noted that NEPC and small cell lung cancer (SCLC) subtypes shared a set of GRNs, indicative of conserved biologic pathways that may be exploited therapeutically across tumor types. While this extreme level of transcriptional heterogeneity, particularly in cell surface marker expression, may mitigate the durability of clinical responses to novel antigen-directed therapies, its delineation may yield signatures for patient selection in clinical trials, potentially across distinct cancer types.Treatment of prostate cancer is rapidly evolving with several promising new drugs targeting different cell surface antigens. Selection of patients most likely to benefit from these therapies requires an understanding of how expression of these cell surface antigens varies across patients and how they change during disease progression, particularly in tumors that undergo lineage plasticity. Using immunohistochemistry and single cell mRNA sequencing, we reveal heterogeneity of cell states across a cohort of advanced disease prostate cancer patients; this heterogeneity is not captured by conventional histology-based designations of adenocarcinoma and neuroendocrine prostate cancer. We show these cell states can be identified by gene regulatory networks that could provide additional diagnostic precision based on their correlation with clinically relevant cell surface antigen expression.

ABSTRACT Lineage plasticity, a capacity to reprogram cell phenotypic identity under evolutionary pressure, is implicated in treatment resistance and metastasis in multiple cancers. In lung adenocarcinomas (LUADs) amenable to treatment with targeted inhibitors, transformation to an aggressive neuroendocrine (NE) carcinoma resembling small cell lung cancer (SCLC) is a recognized mechanism of acquired resistance. Defining molecular mechanisms of NE transformation in lung cancer has been limited by a paucity of well annotated pre- and post-transformation clinical samples. We hypothesized that mixed histology LUAD/SCLC tumors may capture cancer cells proximal to, and on either side of, histologic transformation. We performed detailed genomic, epigenomic, transcriptomic and proteomic characterization of combined LUAD/SCLC tumors as well as pre- and post-transformation clinical samples. Our data support that NE transformation is primarily driven by transcriptional reprogramming rather than mutational events. We identify genomic contexts in which NE transformation is favored, including frequent loss of the 3p chromosome arm in pre-transformation LUADs. Consistent shifts in gene expression programs in NE transformation include induction of several stem/progenitor cell regulatory pathways, including upregulation of PRC2 and WNT signaling, and suppression of Notch pathway activity. We observe induction of PI3K/AKT and an immunosuppressive phenotype in NE transformation. Taken together our findings define a novel landscape of potential drivers and therapeutic vulnerabilities of NE transformation in lung cancer.