ABSTRACT Microbiome is increasingly recognized as a key factor in health. Intestinal microbiota modulates gut homeostasis via a range of diverse metabolites. Molecules such as short chain fatty acids (SCFAs), the microbial fermentation products of dietary fiber, have been established to be reflective of microbiome and/or dietary shifts and have been linked to multiple gastrointestinal disorders from cancer to colitis, and thus present an excellent diagnostic target. Yet, technical bottlenecks preclude broad translation of such established biomarkers into routine medical practice. In particular, easily accessible, reproducible and robust sampling of stool remains challenging. Here we present Stool Wipe (S-Wipe), an ultra low cost, simplified fecal specimen collection approach designed to overcome key translational barriers without compromising analytical rigor. This sampling approach harnesses lint-free mass spectrometry-compatible cellulose wipes used as a regular toilet paper. The collected stool specimens are then preserved in ethanol solution, do not require refrigeration and can be shipped via regular mail. Using mass spectrometry, we have demonstrated a broad range of captured metabolites, both volatile and non-volatile. The reproducibility and stability of the method was validated for a panel of molecules of particular diagnostic interest, including SCFAs and p-cresol. We demonstrate sensitivity as well as stability and reproducibility of various metabolites collected with S-Wipe. We further demonstrate that S-Wipe is equivalent to the direct stool collection and thus could be used interchangeably and compared to other studies where stool is collected directly. This methodology is ideally suited and is scalable for broad population-based studies, longitudinal tracking such as therapeutic interventions and personalized medicine. IMPORTANCE Gut microbiome and intestinal metabolome present invaluable diagnostic and therapeutic targets. However, conventional stool testing has several barriers limiting bioassessment from populations. Routine, high temporal resolution monitoring of stool metabolome, including validated biomarkers such as SCFAs, is not implemented due to relatively high cost and inconvenience of sampling, possible need for clinical setting for sample collection, difficulty to collect samples reproducibly, especially due to possible user errors, requirement for freezer storage and maintaining cold chain during shipment. We present a sampling strategy specifically designed to overcome these obstacles. This method can enable capturing accurate molecular snapshots at massive scales, at ultra low cost. The approach collapses complex medical-grade collection into easy self-administration. Individuals can thereby self-monitor therapeutic responses through routine metabolome tracking, including the volatilome, otherwise hindered by infrastructure restrictions. Ultimately, this sampling approach is intended to enable participatory wellness transformation through practical high frequency self-sampling.

Abstract Huanglongbing (HLB), associated with the psyllid-vectored phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (C Las), is a disease threat to all citrus production worldwide. Currently, there are no sustainable curative or prophylactic treatments available. In this study, we utilized mass spectrometry (MS)-based metabolomics in combination with 3D molecular mapping to visualize complex chemistries within plant tissues to explore how these chemistries change in vivo in HLB-impacted trees. We demonstrate how spatial information from molecular maps of branches and single leaves yields insight into the biology not accessible otherwise. In particular, we found evidence that flavonoid biosynthesis is disrupted in HLB-impacted trees, and an increase in the polyamine, feruloylputrescine, is highly correlated with an increase in disease severity. Based on mechanistic details revealed by these molecular maps, followed by metabolic modeling, we formulated and tested the hypothesis that C Las infection either directly or indirectly converts the precursor compound, ferulic acid, to feruloylputrescine to suppress the antimicrobial effects of ferulic acid and biosynthetically downstream flavonoids. Using in vitro bioassays, we demonstrated that ferulic acid and bioflavonoids are indeed highly bactericidal to C Las, with the activity on par with a reference antibiotic, oxytetracycline, recently approved for HLB management. We propose these compounds should be evaluated as therapeutics alternatives to the antibiotics for HLB treatment. Overall, the utilized 3D metabolic mapping approach provides a promising methodological framework to identify pathogen-specific inhibitory compounds in planta for potential prophylactic or therapeutic applications.

Nature's molecular diversity is not random but displays intricate organization stemming from biological necessity. Molecular networking connects metabolites with structural similarity, enabling molecular discoveries from mass spectrometry data using arbitrary similarity thresholds that can fracture natural metabolite families. We present molecular community networking (MCN), that optimizes connectivity for each metabolite, rescuing lost relationships and capturing otherwise "hidden" metabolite connections. Using MCN, we demonstrate the discovery of novel dipeptide-conjugated bile acids.