In most human cancers, only a few genes are mutated at high frequencies; most are mutated at low frequencies. The functional consequences of these recurrent but infrequent "long tail" mutations are often unknown. We focused on 484 long tail genes in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and used in vivo CRISPR to screen for genes that, upon mutation, trigger tumor development in mice. Of the 15 tumor-suppressor genes identified, ADAM10 and AJUBA suppressed HNSCC in a haploinsufficient manner by promoting NOTCH receptor signaling. ADAM10 and AJUBA mutations or monoallelic loss occur in 28% of human HNSCC cases and are mutually exclusive with NOTCH receptor mutations. Our results show that oncogenic mutations in 67% of human HNSCC cases converge onto the NOTCH signaling pathway, making NOTCH inactivation a hallmark of HNSCC.

Abstract Systematically investigating the scores of genes mutated in cancer and discerning real drivers from inconsequential bystanders is a prerequisite for Precision Medicine, but remains challenging. Here, we developed a somatic CRISPR/Cas9 mutagenesis screen to study 215 recurrent ‘long-tail’ breast cancer genes, which revealed epigenetic regulation as major tumor suppressive mechanism. We report that core or accessory components of the COMPASS histone methylase complex including KMT2C , KDM6A , BAP1 and ASXL2 (“EpiDrivers”) cooperate with PIK3CA H1047R to transform mouse and human breast epithelial cells. Mechanistically, we find that Cre-mediated activation of PIK3CA H1047R elicited an aberrant alveolar lactation program in luminal cells, which was exacerbated upon loss of EpiDrivers. Remarkably, EpiDriver loss in basal cells also triggered an alveolar-like lineage conversion and accelerated formation of luminal-like tumors, suggesting a basal origin for luminal tumors. As EpiDrivers are mutated in 39% of human breast cancers, lineage infidelity and lactation mimicry may significantly contribute to early steps of breast cancer progression. Statement of significance Infrequently mutated genes comprise most of the mutational burden in breast tumors but are poorly understood. In-vivo CRISPR screening identified functional tumor suppressors that converged on epigenetic regulation. Loss of epigenetic regulators accelerated tumorigenesis and revealed lineage infidelity and aberrant expression of lactation genes as potential early events in tumorigenesis.

Abstract Pannexin (PANX) channels are present in skin and facilitate the movement of signalling molecules during cellular communication. PANX1 and PANX3 function in skin homeostasis and keratinocyte differentiation but were previously reduced in a small cohort of human cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) tumours compared to normal epidermis. In our study, we used SCC-13 cells, limited publicly available RNA-seq data and a larger cohort of cSCC patient-matched samples to analyze PANX1 and PANX3 expression and determine the association between their dysregulation and the malignant properties of cSCC. In a bioinformatics analysis, PANX1 transcripts were increased in both cSCC and head and neck SCC tumours compared to normal tissues, but PANX3 mRNA showed no differences. However, in our own patient cohort, PANX3 transcripts were decreased in cSCC tissue compared to patient-matched aged skin, whereas PANX1 was upregulated in cSCC. PANX1 localized to all cell types within the cSCC tumour microenvironment and increased levels were associated with larger tumour dimensions. To investigate PANX1 channel function, we treated SCC-13 cells with PANX1 inhibitors which markedly reduced cell growth and migration. To assess PANX3 function in cutaneous carcinogenesis, we employed the DMBA/TPA carcinoma model using our global Panx3 knockout (KO) mice, where 60% of wildtype and 100% of KO mice formed pre-cancerous papillomas. Average papilloma volumes at endpoint were significantly increased in KO mice and showed moderate evidence of increases in KO mice over time. Collectively, these findings suggest PANX1 and PANX3 dysregulation may have potential tumour promoting and suppressive effects for keratinocyte transformation, respectively. Key points summary Pannexin 1 and pannexin 3 are channel-forming proteins which are critical in the normal maintenance and function of keratinocytes in the skin but may become altered in cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) tumours. In this study, using a combination of culture models, mouse models and patient-derived tissues, we found pannexin 1 levels are increased in cSCC tumours and present in all tumour cell types, functioning to increase cSCC cell growth and migration. On the other hand, pannexin 3 levels are decreased in cSCC tumours and this protein reduces the incidence and growth of pre-cancerous lesions. Taken together, our data indicates that in cSCC these pannexin family members seem to have opposite effects, where pannexin 1 is pro-tumorigenic and pannexin 3 is anti-tumorigenic. These results help us to better understand the mechanisms of malignant transformation of keratinocytes and offer a new potential therapeutic target for the treatment of advanced cSCC.

Acute myeloid leukemia (AML) progression and relapse is fueled by self-renewing leukemic stem cells (LSCs) whose molecular determinants have been difficult to discern from normal hematopoietic stem cells (HSCs) or to uncover in screening approaches focused on general AML cell properties. We have identified a unique set of RNA binding proteins (RBPs) that are enriched in human AML LSCs but repressed in HSCs. Using an in vivo two step CRISPR-Cas9-mediated screening approach to specifically score for cancer stem cell functionality, we found 32 RBPs essential for LSC propagation and self-renewal in MLL-AF9 translocated AML. Using knockdown or small molecule approaches we show that targeting key hit RBP ELAVL1 impaired LSC-driven in vivo leukemic reconstitution and selectively depleted primitive AML cells vs. normal hematopoietic stem and progenitors. Importantly, knockdown of Elavl1 spared HSCs while significantly reducing LSC numbers across genetically diverse leukemias. Integrative RNA-seq and eCLIP-seq profiling revealed hematopoietic differentiation, RNA splicing and mitochondrial metabolism as key features defining the leukemic ELAVL1-mRNA interactome with the mitochondrial import protein TOMM34 being a direct ELAVL1-stabilized target whose inhibition impairs AML propagation. Altogether, through the use of a stem cell-adapted in vivo CRISPR dropout screening strategy, this work demonstrates that a wide variety of post-transcriptionally acting RBPs are important regulators of LSC-survival and self-renewal and, as exemplified by ELAVL1, highlights their potential as therapeutic targets in AML.

Abstract How the genetic landscape of a tumor governs the tumor’s response to immunotherapy remains largely elusive. Here, we established a direct in vivo CRISPR/Cas9 gene editing methodology to assess the immune-modulatory capabilities of 573 putative cancer genes associated with altered cytotoxic activity in human cancers. Using Kras G12D - and Braf V600E -driven mouse lung cancer models, we identify Serpinb9 and Adam2 as our top immune suppressive and immune enhancing genes, respectively. Mechanistically, we show that Serpinb9 ablation in Kras G12D - and Braf V600E -mutant lung tumor cells greatly enhances the efficacy of cytotoxic T-cells in vitro and in vivo . ADAM2 is a cancer testis antigen broadly expressed in human cancers such as lung adenocarcinoma (13.9%), renal (74.7%), prostate (72.4%), uterine (28.6%) and invasive breast (9.5%) cancer. In our mouse models, we show that Adam2 expression is induced in Kras G12D - but not Braf V600E -driven murine lung tumors and that its expression is further enhanced by immunotherapy. We show that loss of Adam2 significantly decreases Kras G12D -lung tumor burden but blocks the efficacy of cytotoxic T-cells. Consistently, Adam2 overexpression dramatically increases tumor growth and enhances immunotherapy efficacy. Mechanistically, we find that Adam2 ’s oncogenic function depends on modulating the tumor immune microenvironment by restraining productive type I and type II interferon responses as well as cytokine signaling, reducing the presentation of tumor-associated antigen, and modulating surface expression of several immunoregulatory receptors within Kras -driven lung tumors. Adam2 expression also leads to reduced levels of immune checkpoint inhibitors such as Pd-l1, Lag3, Tigit and Tim3. This reduced exhaustion within the tumor microenvironment may explain why ex vivo expanded and adoptively transferred cytotoxic T-cells show enhanced cytotoxic efficacy against Adam2 overexpressing lung tumors. Together, our study highlights the power of integrating cancer genomic with in vivo CRISPR/Cas9 screens to uncover how cancer-associated genetic alterations control responses to immunotherapies.

Abstract Pannexin (PANX) channels are present in skin and facilitate the movement of signalling molecules during cellular communication. PANX1 and PANX3 function in skin homeostasis and keratinocyte differentiation but were previously reduced in a small cohort of human cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) tumours compared to normal epidermis. In our study we used SCC‐13 cells, limited publicly available RNA‐seq data and a larger cohort of cSCC patient‐matched samples to analyse PANX1 and PANX3 expression and determine the association between their dysregulation and the malignant properties of cSCC. In a bioinformatics analysis, PANX1 transcripts were increased in cSCC and head and neck SCC tumours compared to normal tissues, but PANX3 mRNA showed no differences. However, in our own cohort PANX3 transcripts were decreased in cSCC compared to patient‐matched aged skin, whereas PANX1 protein was upregulated in cSCC. PANX1 localized to all regions within the cSCC tumour microenvironment, and increased levels were associated with larger tumour dimensions. To investigate PANX1 function in SCC‐13 cells, we deleted PANX1 via CRISPR/Cas9 and treated with PANX1 inhibitors, which markedly reduced cell growth and migration. To assess PANX3 function in cutaneous carcinogenesis, we employed the 7,12‐dimethylbenz(a)anthracene/12‐otetradecanoylphorbol‐13‐acetate (DMBA/TPA) model using our global Panx3 knockout (KO) mice, where 60% of wild‐type and 100% of KO mice formed precancerous papillomas. Average papilloma volumes at endpoint were significantly increased in KO mice and showed moderate evidence of increases in KO mice over time. Collectively, these findings suggest PANX1 and PANX3 dysregulation may have potential tumour‐promoting and tumour‐suppressive effects for keratinocyte transformation, respectively. image Key points Pannexin 1 (PANX1) and pannexin 3 (PANX3) are channel‐forming proteins which are critical in the normal maintenance and function of keratinocytes in the skin but may become altered in cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) tumours. In this study we used a combination of culture models, mouse models and patient‐derived tissues. We found PANX1 levels are increased in cSCC tumours and present in all tumour regions, functioning to promote cSCC cell growth and migration. Conversely, PANX3 levels are decreased in cSCC tumours, and this protein reduces the incidence and growth of precancerous lesions. Taken together our data indicate that in cSCC these pannexin family members seem to have opposite effects, in either promoting or restricting cancer cell properties. These results help us to better understand the mechanisms of malignant transformation of keratinocytes and offer a new potential therapeutic target for the treatment of advanced cSCC.