Bipotent mesendoderm that can give rise to both endoderm and mesoderm is an established entity from C. elegans to zebrafish. Although previous studies in mouse embryo indicated the presence of bi-potent mesendoderm cells in the organizer region, characterization of mesendoderm and its differentiation processes are still unclear. As bi-potent mesendoderm is implicated as the major precursor of definitive endoderm, its identification is also essential for exploring the differentiation of definitive endoderm. In this study, we have established embryonic stem (ES) cell lines that carry GFP gene in the goosecoid (Gsc) gene locus and have investigated the differentiation course of mesendodermal cells using Gsc expression as a marker. Our results show that mesendoderm is represented as a Gsc-GFP+E-cadherin(ECD)+PDGFRα(αR)+population and is selectively induced from ES cells under defined conditions containing either activin or nodal. Subsequently, it diverges to Gsc+ECD+αR- and Gsc+ECD-αR+ intermediates that eventually differentiate into definitive endoderm and mesodermal lineages,respectively. The presence of mesendodermal cells in nascent Gsc+ECD+αR+ population was also confirmed by single cell analysis. Finally, we show that the defined culture condition and surface markers developed in this study are applicable for obtaining pure mesendodermal cells and their immediate progenies from genetically unmanipulated ES cells.

The analysis of RNA-Seq data from individual differentiating cells enables us to reconstruct the differentiation process and the degree of differentiation (in pseudo-time) of each cell. Such analyses can reveal detailed expression dynamics and functional relationships for differentiation. To further elucidate differentiation processes, more insight into gene regulatory networks is required. The pseudo-time can be regarded as time information and, therefore, single-cell RNA-Seq data are time-course data with high time resolution. Although time-course data are useful for inferring networks, conventional inference algorithms for such data suffer from high time complexity when the number of samples and genes is large. Therefore, a novel algorithm is necessary to infer networks from single-cell RNA-Seq during differentiation.In this study, we developed the novel and efficient algorithm SCODE to infer regulatory networks, based on ordinary differential equations. We applied SCODE to three single-cell RNA-Seq datasets and confirmed that SCODE can reconstruct observed expression dynamics. We evaluated SCODE by comparing its inferred networks with use of a DNaseI-footprint based network. The performance of SCODE was best for two of the datasets and nearly best for the remaining dataset. We also compared the runtimes and showed that the runtimes for SCODE are significantly shorter than for alternatives. Thus, our algorithm provides a promising approach for further single-cell differentiation analyses.The R source code of SCODE is available at https://github.com/hmatsu1226/SCODE.hirotaka.matsumoto@riken.jp.Supplementary data are available at Bioinformatics online.

Abstract We report an experimental system in which Escherichia coli evolves into an insect mutualist. When the essential gut symbiont of the stinkbug Plautia stali was replaced by E. coli, a few survivor insects exhibited specific localization and vertical transmission of E. coli. Through trans-generational maintenance with P. stali , several hyper-mutating E. coli lines independently evolved host’s high adult emergence and improved body color. Such “mutualistic” E. coli lines exhibited independent mutations disrupting the carbon catabolite repression (CCR) global transcriptional regulator. Each of the mutations reproduced the mutualistic phenotypes when introduced into wild-type E. coli , confirming that the single CCR mutations instantly make E. coli an insect mutualist. Our discovery uncovers that evolution of elaborate mutualism can proceed more easily and rapidly than conventionally envisaged.

Abstract The rate and direction of phenotypic evolution depend on the availability of phenotypic variants induced genetically or environmentally. It is widely accepted that organisms do not display uniform phenotypic variation, with certain variants arising more frequently than others in response to genetic or environmental perturbations. Previous studies have suggested that gene regulatory networks channel both environmental and genetic influences. However, how the gene regulatory networks influence phenotypic variation remains unclear. To address this, we characterized transcriptional variations in Escherichia coli under environmental and genetic perturbations. Based on the current understanding of transcriptional regulatory networks, we identified genetic properties that explain gene-to-gene differences in transcriptional variation. Our findings highlight the role of gene regulatory networks in shaping the shared phenotypic variability across different perturbations. This study provides insights into how gene regulatory networks have been structured in past environments and generalized to new ones.

ABSTRACT Operons are a hallmark of the genomic and regulatory architecture of prokaryotes. However, the mechanism by which two genes placed far apart gradually come close and form operons remains to be elucidated. Here, we propose a new model of the origin of operons: Mobile genetic elements called insertion sequences can facilitate the formation of operons by consecutive insertion-deletion-excision reactions. This mechanism barely leaves traces of insertion sequences and is difficult to detect in evolution in nature. We performed, to the best of our knowledge, the first experimental demonstration of operon formation, as a proof of concept. The insertion sequence IS 3 and the insertion sequence excision enhancer are genes found in a broad range of bacterial species. We introduced these genes into insertion sequence-less Escherichia coli and found that, supporting our hypothesis, the activity of the two genes altered the expression of genes surrounding IS 3 , closed a 2.7 kilobase pair gap between a pair of genes, and formed new operons. This study shows how insertion sequences can facilitate the rapid formation of operons through locally increasing the structural mutation rates and highlights how coevolution with mobile elements may shape the organization of prokaryotic genomes and gene regulation.

Bacterial cells have a remarkable ability to adapt and evolve to environmental changes, a phenomenon known as adaptive evolution. Adaptive evolution can be explained by phenotypic changes caused by genetic mutations, and by phenotypic plasticity that occur without genetic alteration, although far less is known about the contributions of the latter. In this study, we analyzed phenotypic and genotypic changes in Escherichia coli cells during adaptive evolution to ethanol stress. Phenotypic changes were quantified by transcriptome and metabolome analyses and found similar among independently evolved ethanol tolerant strains. The contribution of identified mutations in the tolerant strain was evaluated by using site-directed mutagenesis, which suggested that the fixation of these mutations cannot fully explain the observed ethanol tolerance. The phenotype of ethanol tolerance was stably maintained after an environmental change, suggesting that a mechanism of non-genetic memory contributed to at least part of the adaptation process.

Bacterial cells have a remarkable capacity to adapt and to evolve to environmental changes. Although many mutations contributing to adaptive evolution have been identified, the relationship between the mutations and the phenotypic changes responsible for fitness gain has yet to be fully elucidated. For a better understanding of phenotype-genotype relationship in evolutionary dynamics, we performed high-throughput laboratory evolution of Escherichia coli under various stress conditions using an automated culture system. One measure of phenotype, transcriptome analysis, revealed that the expression changes which occurred during the evolution were generally similar among the strains evolved in the same stress environment. We also found several genes and gene functions for which mutations were commonly fixed in the strains resistant to the same stress, and whose effects on resistance were verified experimentally. We demonstrated that the integration of transcriptome and genome data enables us to extract the mechanisms for stress resistance.

The analysis of RNA-Seq data from individual differentiating cells enables us to reconstruct the differentiation process and the degree of differentiation (in pseudo-time) of each cell. Such analyses can reveal detailed expression dynamics and functional relationships for differentiation. To further elucidate differentiation processes, more insight into gene regulatory networks is required. The pseudo-time can be regarded as time information and, therefore, single-cell RNA-Seq data are time-course data with high time resolution. Although time-course data are useful for inferring networks, conventional inference algorithms for such data suffer from high time complexity when the number of samples and genes is large. Therefore, a novel algorithm is necessary to infer networks from single-cell RNA-Seq during differentiation. In this study, we developed the novel and efficient algorithm SCODE to infer regulatory networks, based on ordinary differential equations. We applied SCODE to three single-cell RNA-Seq datasets and confirmed that SCODE can reconstruct observed expression dynamics. We evaluated SCODE by comparing its inferred networks with use of a DNaseI-footprint based network. The performance of SCODE was best for two of the datasets and nearly best for the remaining dataset. We also compared the runtimes and showed that the runtimes for SCODE are significantly shorter than for alternatives. Thus, our algorithm provides a promising approach for further single-cell differentiation analyses. The R source code of SCODE is available at https://github.com/hmatsu1226/SCODE.

The process of cell differentiation in multicellular organisms is characterized by hierarchy and irreversibility in many cases. However, the conditions and selection pressures that give rise to these characteristics remain poorly understood. By using a mathematical model, here we show that the network of differentiation potency (differentiation diagram) becomes necessarily hierarchical and irreversible by increasing the number of terminally differentiated states under certain conditions. The mechanisms generating these characteristics are clarified using geometry in the cell state space. The results demonstrate that the appearance of these characteristics can be driven without assuming the adaptive significance. The study also provides a new perspective on the structure of gene regulatory networks that produce hierarchical and irreversible differentiation diagrams. These results indicate some constraints on cell differentiation, which are expected to provide a starting point for theoretical discussion of the implicit limits and directions of evolution in multicellular organisms.

Abstract The evolutionary speed of a protein sequence is constrained by its expression level, with highly expressed proteins evolving relatively slowly. This negative correlation between expression levels and evolutionary rates (known as the E–R anticorrelation) has already been widely observed in past macroevolution between species from bacteria to animals. However, it remains unclear whether this seemingly general law also governs recent evolution, including past and de novo , within a species. However, the advent of genomic sequencing and high-throughput phenotyping, particularly for bacteria, has revealed fundamental gaps between the two evolutionary processes and has provided empirical data opposing the possible underlying mechanisms which are widely believed. These conflicts raise questions about the generalization of the E–R anticorrelation and the relevance of plausible mechanisms. To explore the ubiquitous impact of expression level on molecular evolution, and to test the relevance of the possible underlying mechanisms, we analyzed the genome sequences of 99 strains of Escherichia coli for microevolution in nature. We also analyzed genomic mutations accumulated under laboratory conditions as a model of de novo microevolution. Here, we show that the E–R anticorrelation is significant in both past and de novo microevolution in E. coli . Our data also confirmed ongoing purifying selection acting on highly expressed genes. Ongoing selection included codon-level purifying selection, supporting the relevance of the underlying mechanisms. However, their contributions to the constraints in recent evolution might be smaller than previously expected from past macroevolution.