ABSTRACT High-throughput Plasmodium genomic data is increasingly useful in assessing prevalence of clinically important mutations and malaria transmission patterns. Understanding parasite diversity is important for identification of specific human or parasite populations that can be targeted by control programs, and to monitor the spread of mutations associated with drug resistance. An up-to-date understanding of regional parasite population dynamics is also critical to monitor the impact of control efforts. However, this data is largely absent from high-burden nations in Africa, and to date, no such analysis has been conducted for malaria parasites in Tanzania country-wide. To this end, over 1,000 P. falciparum clinical isolates were collected in 2017 from 13 sites in seven administrative regions across Tanzania, and parasites were genotyped at 1,800 variable positions genome-wide using molecular inversion probes. Population structure was detectable among Tanzanian P. falciparum parasites, roughly separating parasites from the northern and southern districts and identifying genetically admixed populations in the north. Isolates from geographically close districts were more likely to be genetically related compared to parasites sampled from more distant districts. Known drug resistance mutations were seen at increased frequency in northern districts, and additional variants with undetermined significance for antimalarial resistance also varied by geography. Malaria Indicator Survey (2017) data corresponded with genetic findings, including average region-level complexity-of-infection and malaria prevalence estimates. The parasite populations identified here provide important information on extant spatial patterns of genetic diversity of Tanzanian parasites, to which future surveys of genetic relatedness can be compared. SIGNIFICANCE Documenting dynamics of malaria parasite genomics in high-transmission settings at scale in sub-Saharan Africa is critical for policy and decision making to support ongoing malaria elimination initiatives. Using molecular inversion probes, we genotyped over 1,000 Tanzanian Plasmodium falciparum samples collected country-wide in 2017 at hundreds of variable polymorphic positions across the genome. Frequencies of known drug resistance mutations were higher in northern districts of the country compared to the south. Results also showed a distinct isolation-by-distance pattern (whereby increasing geographic distance was correlated with decreasing genetic relatedness), as well as signals of higher genetic sharing between several southern districts. These results provide, for the first time, a picture of current within-country diversity of Tanzanian P. falciparum populations.

Antiretroviral therapy (ART) suppresses HIV-1 viremia and prevents progression to AIDS. Nonetheless, chronic inflammation is a common problem for people living with HIV-1 on ART. One possible cause of inflammation is ongoing transcription from HIV-1 proviruses, whether or not the sequences are competent for replication. Previous work has shown that intron-containing RNA expressed from the HIV-1 provirus in primary human blood cells, including CD4+ T cells, macrophages, and dendritic cells, activates type 1 interferon. This activation required HIV-1 rev and was blocked by the XPO1 (CRM1)-inhibitor leptomycin. To identify the innate immune receptor required for detection of intron-containing RNA expressed from the HIV-1 provirus, a loss-of-function screen was performed with shRNA-expressing lentivectors targeting twenty-one candidate genes in human monocyte derived dendritic cells. Among the candidate genes tested, only knockdown of XPO1 (CRM1), IFIH1 (MDA5), or MAVS prevented activation of the IFN-stimulated gene ISG15. The importance of IFIH1 protein was demonstrated by rescue of the knockdown with non-targetable IFIH1 coding sequence. Inhibition of HIV-1-induced ISG15 by the IFIH1-specific Nipah virus V protein, and by IFIH1-transdominant inhibitory CARD-deletion or phosphomimetic point mutations, indicates that IFIH1 filament formation, dephosphorylation, and association with MAVS, are all required for innate immune activation in response to HIV-1 transduction. Since both IFIH1 and DDX58 (RIG-I) signal via MAVS, the specificity of HIV-1 RNA detection by IFIH1 was demonstrated by the fact that DDX58 knockdown had no effect on activation. RNA-Seq showed that IFIH1-knockdown in dendritic cells globally disrupted the induction of IFN-stimulated genes. Finally, specific enrichment of unspliced HIV-1 RNA by IFIH1 was revealed by formaldehyde crosslinking immunoprecipitation (f-CLIP). These results demonstrate that IFIH1 is required for innate immune activation by intron-containing RNA from the HIV-1 provirus, and potentially contributes to chronic inflammation in people living with HIV-1.

Endemic Burkitt lymphoma (eBL), the most prevalent pediatric cancer in sub-Saharan Africa, is associated with malaria and Epstein Barr virus (EBV). In order to better understand the role of EBV in eBL, we improved viral DNA enrichment methods and generated a total of 98 new EBV genomes from both eBL cases (N=58) and healthy controls (N=40) residing in the same geographic region in Kenya. Comparing cases and controls, we found that EBV type 1 was significantly associated with eBL with 74.5% of patients (41/55) versus 47.5% of healthy children (19/40) carrying type 1 (OR=3.24, 95% CI=1.36 - 7.71, P=0.007 ). Controlling for EBV type, we also performed a genome-wide association study identifying 6 nonsynonymous variants in the genes EBNA1, EBNA2, BcLF1, and BARF1 that were enriched in eBL patients. Additionally, we observed that viruses isolated from plasma of eBL patients were identical to their tumor counterpart consistent with circulating viral DNA originating from the tumor. We also detected three intertypic recombinants carrying type 1 EBNA2 and type 2 EBNA3 regions as well as one novel genome with a 20 kb deletion resulting in the loss of multiple lytic and virion genes. Comparing EBV types, genes show differential variation rates as type 1 appears to be more divergent. Besides, type 2 demonstrates novel substructures. Overall, our findings address the complexities of EBV population structure and provide new insight into viral variation, which has the potential to influence eBL oncogenesis.Key Points

Abstract Plasmodium ovale curtisi ( Poc) and Plasmodium ovale wallikeri ( Pow ) are relapsing malaria parasites endemic to Africa and Asia that were previously thought to represent a single species. Amid increasing detection of ovale malaria in sub-Saharan Africa, we present a population genomic study of both species across the continent. We conducted whole-genome sequencing of 25 isolates from Central and East Africa and analyzed them alongside 20 previously published African genomes. Isolates are predominantly monoclonal (43/45), with their genetic similarity aligning with geography. Pow shows lower average nucleotide diversity (1.8×10 −4 ) across the genome compared to Poc (3.0×10 −4 ) (p < 0.0001). Signatures of selective sweeps involving the dihydrofolate reductase gene have been found in both species, as are signs of balancing selection at the merozoite surface protein 1 gene. Differences in the nucleotide diversity of Poc and Pow may reflect unique demographic history, even as similar selective forces facilitate their resilience to malaria control interventions.

Background: Tanzania's Zanzibar archipelago has made significant gains in malaria control over the last decade and is a target for malaria elimination. Despite consistent implementation of effective tools since 2002, elimination has not been achieved. Importation of parasites from outside of the archipelago is thought to be an important cause of malaria's persistence, but this paradigm has not been studied using modern genetic tools. Methods: We used whole-genome sequencing (WGS) to investigate the impact of importation, employing population genetic analyses of Plasmodium falciparum isolates from both the archipelago and mainland Tanzania. We assessed ancestry, levels of genetic diversity and differentiation, patterns of relatedness, and patterns of selection between these two populations by leveraging recent advances in deconvolution of genomes from polyclonal malaria infections. Results: We identified significant decreases in the effective population sizes in both populations in the timeframe of decreasing malaria transmission in Tanzania. Identity by descent analysis showed that parasites in the two populations shared large sections of their genomes, on the order of 5 cM, suggesting shared ancestry within the last 10 generations. Even with limited sampling,, we demonstrate a pair of isolates between the mainland and Zanzibar that are related at the expected level of half-siblings, consistent with recent importation. Conclusions: These findings suggest that importation plays an increasing role for malaria incidence on Zanzibar and demonstrate the value of genomic approaches for identifying corridors of parasite movement to the island.

Abstract Plasmodium ovale curtisi ( Poc) and Plasmodium ovale wallikeri ( Pow ) are relapsing malaria parasites endemic to Africa and Asia that were previously thought to represent a single species. Amid increasing detection of ovale malaria in sub-Saharan Africa, we performed a population genomic study of both species across the continent. We conducted whole-genome sequencing of 25 isolates from central and east Africa and analyzed them alongside four previously published west and central African genomes. Isolates were predominantly monoclonal (27/29), with their genetic similarity aligning with geography. Pow showed lower average nucleotide diversity (1.9×10 -4 ) across the genome compared to Poc (2.8×10 -4 ) (p < 0.0001). Signatures of selective sweeps involving the dihydrofolate reductase gene were found in both species, as were signs of balancing selection at the merozoite surface protein 1 gene. Differences in the nucleotide diversity of Poc and Pow may reflect unique demographic history, even as similar selective forces facilitate their resilience to malaria control interventions.

Abstract In malaria, individuals are often infected with different parasite strains; the complexity of infection (COI) is defined as the number of genetically distinct parasite strains in an individual. Changes in the mean COI in a population have been shown to be informative of changes in transmission intensity with a number of probabilistic likelihood and Bayesian models now developed to estimate the COI. However, rapid, direct measures based on heterozygosity or FwS do not properly represent the COI. In this work, we present two new methods that use easily calculated measures to directly estimate the COI from allele frequency data. Using a simulation framework, we show that our methods are computationally efficient and comparably accurate to current methods in the literature. Through a sensitivity analysis, we characterize how the bias and accuracy of our two methods are impacted by the distribution of parasite densities and the assumed sequencing depth and number of sampled loci. We further estimate the COI globally from Plasmodium falciparum sequencing data using our developed methods and compare the results against the literature. We show significant differences in estimated COI globally between continents and a weak relationship between malaria prevalence and COI. Author summary Computational models, used in conjunction with rapidly advancing sequencing technologies, are increasingly being used to help inform surveillance efforts and understand the epidemiological dynamics of malaria. One such important metric, the complexity of infection (COI), indirectly quantifies the level of transmission. Existing “gold-standard” COI measures rely on complex probabilistic likelihood and Bayesian models. As an alternative, we have developed the statistics and software package coiaf , which features two rapid, direct measures to estimate of the number of genetically distinct parasite strains in an individual (the COI). Our methods were evaluated using simulated data and subsequently compared to current “state-of-the-art” methods, yielding comparable results. Lastly, we examined the distribution of the COI in several locations across the world, identifying significant differences in COI between continents. coiaf , therefore, provides a new, promising framework for rapidly characterizing polyclonal infections.

Background: Targeted next generation sequencing offers the potential for consistent, deep coverage of information rich genomic regions to characterize polyclonal Plasmodium falciparum infections. However, methods to identify and sequence these genomic regions are currently limited. Methods: A bioinformatic pipeline and multiplex methods were developed to identify and simultaneously sequence 100 targets and applied to dried blood spot (DBS) controls and field isolates from Mozambique. For comparison, WGS data were generated for the same controls. Results: Using publicly available genomes, 4465 high diversity genomic regions suited for targeted sequencing were identified, representing the P. falciparum heterozygome. For this study, 93 microhaplotypes with high diversity (median HE = 0.7) were selected along with 7 drug resistance loci. The sequencing method achieved very high coverage (median 99%), specificity (99.8%) and sensitivity (90% for haplotypes with 5% within sample frequency in DBS with 100 parasites/microlitre). In silico analyses revealed that microhaplotypes provided much higher resolution to discriminate related from unrelated polyclonal infections than biallelic SNP barcodes. Discussion: The bioinformatic and laboratory methods outlined here provide a flexible tool for efficient, low-cost, high throughput interrogation of the P. falciparum genome, and can be tailored to simultaneously address multiple questions of interest in various epidemiological settings.

The Democratic Republic of the Congo (DRC) harbors 11% of global malaria cases, yet little is known about the spatial and genetic structure of the parasite population in that country. We sequenced 2537 Plasmodium falciparum infections, including a nationally representative population sample from DRC and samples from surrounding countries, using molecular inversion probes - a novel high-throughput genotyping tool. We identified an east-west divide in haplotypes known to confer resistance to chloroquine and sulfadoxine-pyrimethamine. Furthermore, we identified highly related parasites over large geographic distances, indicative of gene flow and migration. Our results were consistent with a background of isolation by distance combined with the effects of selection for antimalarial drug resistance. This study provides a high-resolution view of parasite genetic structure across a large country in Africa and provides a baseline to study how implementation programs may impact parasite populations.

Plasmodium vivax transmission occurs throughout the tropics and is an emerging threat in areas of Plasmodium falciparum decline, causing relapse infections that complicate treatment and control. Targeted sequencing for P. falciparum has been widely deployed to detect population structure and the geographic spread of antimalarial and diagnostic resistance. However, there are fewer such tools for P. vivax. Leveraging global variation data, we designed four molecular inversion probe (MIP) genotyping panels targeting geographically differentiating SNPs, neutral SNPs, putative antimalarial resistance genes, and vaccine candidate genes. We deployed these MIP panels on 866 infections from the Peruvian Amazon and identified transmission networks with clonality (IBD[identity by descent]>0.99), copy number variation in Pvdbp and multiple Pvrbps, mutations in antimalarial resistance orthologs, and balancing selection in 13 vaccine candidate genes. Our MIP panels are the broadest genotyping panel currently available and are poised for successful deployment in other regions of P. vivax transmission.